【摘要】:目的探讨c-Jun氨基末端激酶2(c-JunN-terminalkinase,JNK2)信号通路对自然杀伤(NK)细胞肿瘤杀伤效应的影响。方法采用Westernblot检测活化淋巴细胞中JNK信号及其上游激酶的磷酸化情况;采用体外杀伤试验和流式细胞技术检测JNK2缺失对NKG2D(natural-killergroup2memberD)介导的NK细胞效应细胞因子产生及肿瘤杀伤的影响;利用JNK2基因敲除小鼠构建移植瘤模型,对其皮下肿瘤生长情况进行观察和检测,并与野生型小鼠进行比较。结果淋巴细胞早期活化伴随着JNK及其上游激酶的活化。肿瘤细胞表达的高亲和力NKG2D配体可显著增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。当JNK2信号通路缺失后,经NKG2D介导的NK细胞效应细胞因子产生及肿瘤清除的能力均显著减弱,进而导致机体肿瘤控制能力减弱。结论JNK2信号通路对由NKG2D介导的NK细胞活化、NK细胞的肿瘤清除和免疫监视能力具有重要的调节作用。
   
   【关键词】:肿瘤免疫;细胞杀伤;JNK;NK细胞;NKG2D
   
   讨论
   JNK基因编码相对分子质量为46×103和54×103两种蛋白产物,它们通过不同选择性剪切方式产生约10种不同的JNK亚型,这10种不同的剪接变体亚型均含有“Thr-Pro-Tyr(TPY)”这一特征性模块结构,即双磷酸化位点。JNK通路的调节有3个层面,即上游激酶、下游底物和支架蛋白;同时JNK信号通路又存在着与细胞内其他信号通路的相互联系(cross-talking),保证了JNK能对胞外的各种信号做出有效、特异的应答,从而更好地调控细胞的多种生命过程。JNK1和JNK2作为JNK家族中的两个主要功能成分广泛存在于多种组织包括免疫细胞中。在固有和适应性免疫应答中,细胞外的刺激通过多种细胞表面受体,如细胞因子受体、B细胞或T细胞受体、Toll样受体等激活JNK的上游激酶MKK4和MKK7,进而JNK被MKK4/MKK7磷酸化其第183位苏氨酸残基(Thr183)和第185位酪氨酸残基(Tyr185)而被活化[23]。MKK4和MKK7均能诱导JNK活化,但其各自的具体作用尚存在争议[24]。本研究发现,在淋巴细胞活化早期MKK4和MKK7均出现磷酸化;但当JNK2信号通路缺失时,MKK4磷酸化明显增强,伴随着MKK7磷酸化的消失(图5)。这是否提示MKK7不参与JNK1信号通路的活化,且在JNK2-/-小鼠中,由于JNK1信号代偿性增加导致MKK4高磷酸化的出现?这一假设有待进一步研究证实。JNK对适应性免疫具有重要的调节作用,本组近年来的研究证实JNK信号参与调节杀伤性T淋巴细胞的激活、增殖和免疫应答。NK细胞与杀伤性T淋巴细胞共同介导细胞免疫应答,在机体抗感染和抗肿瘤免疫,以及肿瘤免疫监视中发挥着至关重要的作用。NK细胞的效应机制与杀伤性T淋巴细胞极为相近,有理由推断JNK对NK细胞的活化和功能同样具有重要的调节作用。本研究对小鼠体内移植瘤的早期生长进行观测,发现JNK2-/-和WT小鼠对鼠T淋巴细胞瘤RMA的控制无明显的差异。但当采用表达NKG2D配体的RMA-Mult1细胞瘤,JNK2-/-小鼠的肿瘤控制能力较之WT小鼠明显降低。由于在荷瘤过程中各品系小鼠的一般情况无明显差异,这种肿瘤控制能力的降低并非由于小鼠自身原因引起。NK细胞的活化由抑制受体和活化受体间的平衡所调控。正常情况下,NK细胞表面的抑制受体与经典或非经典的MHCⅠ类分子结合,传导抑制信号,控制NK细胞的杀伤功能,避免对正常细胞的损害。当活化受体NKG2D与配体结合后,通过衔接蛋白传导激活信号,激活NK细胞功能[25]。已经发现与小鼠相关的NKG2D的配体包括:小鼠视黄酸早期转录子-1(RAE-1)、小鼠次要组织相容分子H60及小鼠ULBP样转录子-1(MULT-1)。MULT-1是较晚鉴定的小鼠NKG2D的配体,在所有配体中与NKG2D的亲和力最高。本研究发现由NKG2D介导的NK杀伤受JNK2信号调节,体内和体外试验均证实,JNK2-/-小鼠NK细胞对RMA细胞的杀伤能力与WT小鼠无明显区别,但对RMA-Mult1细胞的杀伤能力显著降低,提示在NKG2D介导的NK细胞效应中,JNK2具有重要的调节作用。YAC-1是NK杀伤试验中最为常用的靶细胞,其机制正是通过自身表达的NKG2D配体(包括MULT-1和RAE-1)诱导NK杀伤。采用YAC-1得到的NK细胞杀伤试验结果与RMA-Mult1非常相近,印证了上述结论。进一步的研究发现,JNK2缺失后,小鼠NK细胞产生IFN-γ的能力亦明显下降。由此推测,JNK2缺失可同时导致NK细胞效应细胞因子产生及杀伤效应降低,进而导致机体对肿瘤的免疫监视和清除能力下降。近年来随着NKG2D及其配体的发现和研究的不断深入,对它们的功能及在抗感染和抗肿瘤免疫方面的作用有了进一步的认识。但对于NK细胞激活受体和抑制受体的表达及其调控机制,目前仍知之不多。NK不仅是固有免疫应答的效应细胞,而且在适应性免疫的建立和调节过程中也起着关键作用[27-28]。本研究对JNK2在调控NKG2D介导的NK细胞功能中的作用进行了初步探讨,期待今后对JNK信号通路对固有和适应性免疫的多重调控机制进行更为深入的探索。
   
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