【摘要】:目的探讨卡介苗(BCG)感染对巨噬细胞表面NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1和ULBP2)表达的影响,以及黄芩苷对配体表达及NK细胞杀伤活性的影响。方法佛波醇酯(PMA)诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,建立BCG感染巨噬细胞模型,进一步用黄芩苷干预感染模型,分别采用real-timePCR和Westernblot检测MICA、MICB、ULBP1和ULBP2mRNA水平和蛋白表达水平。人外周血单个核细胞(PBMC)诱导分化扩增的NK细胞与感染后巨噬细胞共孵育4h后,采用RTCADP实时无标记细胞分析仪检测NK细胞的杀伤活性。结果BCG感染可上调MICA、MICB、ULBP1和ULBP2mRNA水平和MICA、ULBP1蛋白表达水平。1mg/L黄芩苷处理72h后可显著促进MICA和ULBP1mRNA和蛋白表达,并增加NK细胞对BCG感染后巨噬细胞的杀伤率。结论BCG感染可诱导人巨噬细胞NKG2D配体表达增加,但不能有效活化NK细胞;黄芩苷可进一步上调感染后巨噬细胞表达NKG2D配体,进而促进NK细胞杀伤活性。
   
   【关键词】:黄芩苷;结核分枝杆菌;巨噬细胞;NK细胞;NKG2D
   
   讨论
   结核病(tuberculosis)是由胞内寄生菌M.tb感染所引起的慢性传染性疾病[12],从其免疫防御机制来看,虽以T淋巴细胞介导的适应性免疫应答为主[13],但是如何调动固有免疫细胞参与早期抗结核免疫,是近年来研究人员较为关注的方向。业已证实NK细胞在结核病发病早期即可经活化,直接杀伤受感染的巨噬细胞等宿主靶细胞;并可分泌IFN-γ等细胞因子促进吞噬细胞和CD8+T细胞清除M.tb;近来则有报道,NK细胞也可以被M.tb激活,释放穿孔素和颗粒酶,直接破坏细菌的细胞壁结构[14]。可见NK细胞在抗结核感染中具有重要作用。虽然早在1983年,即有对活动性肺结核病患者体内NK细胞活性分析的报道,并提出NK细胞的杀伤活性参与抗结核免疫[15],但目前对NK细胞在抗结核感染免疫中的作用认识还很有限。NKRs配体表达的种类及强弱是NK细胞活化和杀伤与否的关键,也是药物作用的有效靶点之一。目前较为明确地参与识别M.tb感染细胞并活化NK细胞的激活型受体有NKG2D和NKp46[16-17]。其中,NKG2D是介导NK细胞活化的关键受体,存在种属差异,配体表达也各有不同,在人类主要有MHCⅠ类分子相关蛋白A/B(majorhistocompatibili-tycomplexclassⅠchain-relatedprotein,MICA/B)和UL16结合蛋白(UL16-bindingprotein,ULBP)1~6[17]。受体/配体经诱导契合(stressinduced-fit)机制互相识别后,实现NK细胞对病原体及其所感染靶细胞的识别和清除,有效抑制病原体的免疫逃逸。有观点认为正常成人细胞中不表达或低表达这些配体,而在感染等危险信号可诱导并上调配体表达[18]。某些配体也可在M.tb感染的细胞上调表达,如Vankayalapati等[16]认为ULBP1在M.tb感染的肺泡巨噬细胞上调表达,而MICA/B、ULBP2和ULBP3等配体没有改变;Das等[19]则发现,M.tb感染可在体外诱导DC和肠上皮细胞株MICA表达。我们在研究中以NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2为靶点,首先建立BCG感染人THP-1分化的巨噬细胞模型,分析感染对巨噬细胞表达NKG2D配体是否具有影响。结果显示,感染72h后可以显著促进MICA和ULBP1的mRNA和蛋白表达水平,初步证实BCG的持续感染可显著上调MICA、ULBP1mRNA和蛋白表达水平以及MICB、ULBP2mRNA水平,与文献报道一致。但仅在感染初期(24h)提高NK细胞杀伤活性,继而杀伤活性逐渐受到抑制,致72h显著低于对照组,这个结果与MICA和ULBP1表达水平不完全一致。其可能原因在于:NK细胞的活化受到多种类型受体及其配体的调控,尽管BCG的感染可以上调如MICA和ULBP1等配体的表达,但其所提供的活化信号毕竟有限,难以发挥NK细胞杀伤活性,因此对其他活化信号或抑制信号尚需做进一步研究。本研究所选用的中药单体(黄芩苷)来自于中医临床验方“芩部丹”。据资料显示,“芩部丹”在临床上作为医院制剂用于治疗对抗结核化疗药物产生耐药性的开放性肺结核患者,痰菌转阴率高达47%;治疗难治性肺结核患者,痰菌转阴率可达34.5%,均取得了较明显的临床疗效[6]。但此方的抗痨机制尚未阐明。本课题组近年来对该方的免疫药理机制加以研究,发现构成“芩部丹”3种中药的主要单体(黄芩苷、对叶百部碱、丹参酚酸B)可以通过干预M.tb感染的巨噬细胞的TLR2/MyD88信号传导途径来激活巨噬细胞,清除感染[7-9]。这些研究结果为“芩部丹”通过增强宿主巨噬细胞介导的固有免疫机制来实现抗痨功效提供了线索。本研究在此基础上选用黄芩苷来干预BCG感染人巨噬细胞模型,进一步评价巨噬细胞表达激活型NKRs配体的情况及其对NK细胞活性的影响。结果显示,黄芩苷可诱导BCG感染后巨噬细胞MICA和ULBP1的mRNA和蛋白表达,随时间延长,表达持续增加。且黄芩苷在干预BCG感染巨噬细胞72h后,可以有效促进对NK细胞杀伤活性。故推测黄芩苷可以通过上调BCG感染后巨噬细胞表面NKG2D配体的表达,促进NK细胞活化,参与抗结核感染的早期固有免疫防御。综上所述,本文推测在M.tb感染早期,NK细胞活化信号虽有所增加,但与抑制型信号相比较信号仍较弱,造成了NK细胞无法有效活化,从而使受M.tb感染的靶细胞逃避了NK细胞的免疫监视,而药物黄芩苷一定程度上调了激活型NKRs配体表达,促进NK细胞的活化和杀伤,有利于M.tb感染的清除。本研究结果为“芩部丹”临床治疗肺结核病提供了一定的理论依据,也为抗痨药物的筛选提供了新的靶点。
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