【摘要】背景研究证实,有多种细胞参与增生性玻璃体视网膜病变(PVR)的发生和发展过程,其中RPE细胞的上皮一间质转化(EMT)可能与PVR有关,其主要生物学行为是RPE细胞的增生和迁移。已证实高血糖是糖尿病视网膜病变(DR)发病的主要原因,而高糖条件下RPE细胞是否发生EMT鲜有报道。目的建立体外高糖细胞培养模型,探讨高糖对人RPE的迁移能力及EMT的影响。方法用含质量分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基对人RPE细胞D407细胞株进行体外培养和传代,取6~8代细胞用于实验。依据培养液中血糖浓度的不同将细胞分为3个组,正常对照组培养基中葡萄糖终浓度为5.5mmol/L,高糖培养组葡萄糖终浓度为60.0mmol/L,用含5.5mmol/L葡萄糖和甘露醇的DMEM培养基培养细胞作为高渗对照组。采用细胞划痕试验法检测划痕后0、24、48和72h时3个组RPE细胞的迁移率,用实时荧光定量PCR(real-timePCR)检测高糖培养组在培养不同时间点RPE细胞间质化标志物闭锁小带蛋白-1(ZO-1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA在细胞中的相对表达水平。结果正常对照组培养的RPE细胞呈多角形,核仁清晰,排列致密;高糖培养组随着培养时间的延长,RPE细胞逐渐变大、变长,细胞结构不清,排列紊乱;高渗对照组细胞结构接近正常对照组。划痕试验显示,高糖培养组在划痕后48h可见细胞迁移,划痕后72h划痕基本消失,而正常对照组和高渗对照组划痕仍然存在。划痕后各时间点高糖培养组细胞迁移率明显高于正常对照组和高渗对照组,组间和各时间点的差异均有统计学意义(F分组=328.600,P=0.000;F时间=773.270,P=0.000)。RT-PCR结果显示,与正常对照组相比,高糖培养后48h、72h组细胞中ZO-1mRNA的表达水平明显低于正常对照组,而α-SMAmRNA的表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<O.05)。结论高糖条件下RPE细胞的迁移能力增强,发生EMT改变,可能参与增生性糖尿病视网膜病变(PDR)的发生。
   
   【关键词】人;视网膜色素上皮细胞;高糖;上皮-间质转化;糖尿病/并发症,视网膜病变;细胞培养
   
   
   3讨论
   目前普遍认为DR的始动因素为高血糖、组织缺血及缺氧。RPE细胞从神经视网膜分化而来,是具有分泌功能的上皮细胞,位于视网膜感觉层和脉络膜层之间,是上皮与间充质问的联系组织,参与构成血一视网膜屏障,对维持视网膜生理功能具有极其重要的作用。生理情况下,由于视网膜神经感觉层代谢活动所需的能量在很大程度上是RPE细胞从脉络膜毛细血管转运的葡萄糖所提供,因此RPE细胞更容易受血糖水平的影响。Giebel等研究证实,高血糖可以引起RPE细胞损伤,影响视网膜的外屏障功能,继而引发DR。Hiscott等研究证实,RPE细胞是PDR增生膜的组成部分。此外,在创伤、炎症等条件下,RPE细胞参与增生性玻璃体视网膜病变的发生及糖尿病视网膜新生血管的形成。本实验通过体外培养人RPE细胞,利用在细胞培养液中加入60.0mmol/L高糖的方法制造体外培养细胞的高糖模型,采用划痕试验法及real-timePCR分别检测了高糖对体外培养RPE细胞的迁移能力和EMT相关指标ZO-l和α-SMA表达水平的变化,结果证实在体外高糖条件下,RPE细胞表型发生改变,迁移能力增强,发生EMT。