关键词:肝脏原位灌注 非实质细胞提取 细菌培养皿 接种环 接种针

 

  乙醚麻醉后将小鼠固定于无菌操作台木板上,以20%酒精反复消毒,剪开腹膜腔,解剖出小鼠肝脏,显露出门静脉,以空针穿刺肝后下腔静脉抽血,留存血液标本,剪开胸腔,剖开心脏,同时经门静脉穿刺缓慢匀速(0.5ml/10s)灌注以0.1%PBS10ml,见肝脏逐渐变为黄褐色,此时以镊子掀起肝镰状韧带,将肝脏完整地从腹腔内切取下来,留取一小叶肝组织,福尔马林固定,剩余肝组织用作分离KCs;将肝脏放入盛有预冷PBS液的无菌培养皿中,修剪去掉胆囊及结缔组织并漂洗,随后将肝脏转移入另一无菌培养皿中;向盛有肝脏的培养皿中加入37℃0.1%Ⅳ胶原酶溶液,以镊子配合剪刀将肝脏碎成小块(0.1-0.2cm/块),5分钟内完成操作并将之转移至10ml离心管中;将离心管放入37℃恒温水浴箱内,每隔10分钟吹打一次,2-3分钟/次,共2次,总消化时间控制在30-40分钟;将肝脏消化液以200目滤网过滤后,将滤液转移至离心管中准备离心;第一次离心去除红细胞、血小板及胶原酶,参数为,4℃、300g、5min,弃上清,留沉淀,加入DMEM完全培养基10ml,吹打均匀;第二次离心,4℃、300g、5min,弃上清,留沉淀,加入DMEM完全培养基10ml,吹打均匀;第三次离心,4℃、50g、3min,弃沉淀,留上清,目的去除肝细胞;第四次离心,4℃、300g、5min,弃上清,留沉淀;沉淀内加入DMEM完全培养基10ml,吹打均匀,种于培养瓶内,37℃、5%CO2培养箱内培养。最终的细胞悬液中的细胞大部分为KCs,其次为内皮细胞,另外还有少量大而圆的肝细胞及体积较小的红细胞。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm