关键词:免疫组织 化学染色 GFP 细菌培养皿 接种环 接种针

 

(1)取材:转染48h后活杀一批荷瘤兔,取肿瘤组织,常规固定,石蜡包埋组织,4μm切片。

(2)脱蜡、水化:用二甲苯(Ⅰ)浸洗5min,二甲苯(Ⅱ)浸洗5min;用梯度乙醇(100%,95%,90%,80%,70%)各浸洗1次,每次3min,接着用PBS在脱色摇床上漂洗切片2次,每次5min。

(3)洗涤:用PBS在脱色摇床上漂洗切片2次,每次5min。

(4)用蒸馏水配制新鲜的3%H2O2,37℃室温封闭10min,用蒸馏水洗涤3次。

(5)热抗原修复:水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲液(ph6.0)至95℃左右,放入组织切片加热15min,冷却后使用PBS洗5分钟。

(6)封闭抗原:滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟,甩去多余液体。

(7)滴加稀释后一抗(鼠抗兔单克隆抗体,1:100稀释)50μl,室温静置60min。阴性对照不加一抗,其余步骤和实验组相同。孵育完成后,PBS洗3次,每次5min。

(8)滴加生物素化二抗(山羊抗鼠IgG),37℃,湿盒孵育20min,PBS洗3次,每次5min。(9)滴加试剂SABC,37℃,湿盒孵育20min,PBS洗4次各5min。

(10)DAB显色:按1mlddH2O加显色剂A、B、C各1滴,混匀,在组织处加100μlDAB工作液,25℃反应15min,反应结束后,使用PBS漂洗3次,每次5min。

(11)复染、脱水:使用苏木素复染3s后,立即用自来水冲洗,梯度酒精脱水(70%乙醇5min-75%乙醇5min-80%乙醇5min-95%乙醇5min-100%乙醇10min-100%乙醇10min),二甲苯透明10min,晾干滴一滴中性树胶封片。

(12)镜检、拍照、分析:抗GFP的单克隆抗体标记的GFP蛋白表达于细胞浆或/和细胞核中,呈棕黄色颗粒为阳性细胞,使用imageproplus6.0软件对免疫组化图片进行半定量分析,保持显微镜下相同光强度,数码相机白平衡等功能关掉,照相各参数全部用手动设置,各组图片设置参数均相同进行拍照。调整imageproplus6.0程序系统的灰度单位转换为光密度单位,把图像中呈现黄色区域作为AOI(areaofinterest)进行光密度测定分析,选择测量area面积,density(mean)平均光密度和IOD(intergratedopticaldenesty)累计光密度。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm