关键词:细菌转化 质粒提取 细胞培养板 细胞培养瓶

 

①制备感受态细菌:吸取5μl已经过夜培养的DH5α大肠杆菌菌液(浓度不详)至30ml无抗性LB液体培养基中,放入培养箱于37℃,200rpm的条件下摇菌9~12h(此时OD600值为0.5左右)。取1ml菌液于1.5mlEP管,以4000rpm离心4.5min去上清留沉淀。然后加入0.1ml预冷SSCS液重悬菌体,注意轻柔吹打均匀,制备好的感受态细菌于-80℃保存待用。

②细菌转化:在制备好的感受态细菌菌液中加入1μl质粒DNA,轻柔吹打均匀后冰上放置30min,然后42℃水浴加热90s,之后立即重新放置于冰上20min,加入0.8ml无抗性LB液体培养基于37℃,200rpm的条件下摇菌1h。

③细菌筛选培养:将上一步的细菌均匀涂抹于含氨苄青霉素的LB固体培养基上,培养板倒扣放置于培养箱中37℃培养过夜。用10μl枪头挑取细菌单克隆菌落加入30ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中,放入培养箱于37℃,200rpm的条件下摇菌过夜。吸取0.5ml培养过夜的含有目的质粒DNA的细菌菌液于0.5ml的50%甘油-水溶液中-80℃长期保存。

④质粒提取与验证:质粒DNA的提取按照TAKARA公司的MiniBESTPlasmidPurificationKit试剂盒说明进行操作。提取好的质粒DNA用核酸蛋白含量检测仪测定浓度,保证OD260:OD280在1.7~2.0范围内。随后配制1%琼脂糖凝胶,在靠近黑色电极一侧加样品(质粒DNA与6×DNA上样缓冲液以5:1体积比例混合)和5μlDNAmarker,以150V、500mA条件电泳30min。电泳完毕后放置于凝胶成像分析系统照紫外光检测目的条带,以最终确定细菌转化成功。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm