关键词:质粒 细胞培养板 细胞培养瓶

 

(1)miR-203过表达质粒的扩增

①自-70℃冰箱中取出已转化了miR-203过表达质粒的感受态大肠杆菌,插入湿冰中溶解15min,轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml离心管中,剩余细菌放回-70℃冰箱。加入5ul质粒,轻轻混匀,静置冰上30min。

②于42℃水浴中热休克细菌45sec,迅速移入湿冰中,静置2min,加入900ul不含抗生素的LB液体培养基,放入37℃恒温箱摇床培养1h。取50ul涂于含氨苄青霉素的LB琼脂平板皿上,待干燥后,倒置,存放于37℃的培养箱中过夜。

③小摇:LB液体培养基中加入200ul氨苄青霉素储存液,混匀。取200ul含氨苄青霉素的LB液体培养基移入10ml的离心管中,挑取琼脂平板上单一菌落,接种到上诉LB培养液中,37℃恒温箱摇床培养8h。

④大摇:取200ml含氨苄青霉素的LB液体培养基移入250ml的锥形瓶中,取菌液200ul接种到LB培养液中,37℃恒温箱摇床培养24h。

(2)miR-203过表达质粒的提取按照鼎国的无内毒素质粒大提试剂盒的说明书,提取并纯化目的质粒,使用96孔UV板,将质粒稀释20倍(95ulDEPC水中加5ul质粒),用酶标仪测定质粒的吸光度A260和A280的值并计算质粒的纯度和浓度。

(3)质粒纯度和浓度的判定纯的质粒,1.8<=OD260/OD280<=1.9;若OD260/OD280>2,说明有RNA残留或DNA变性解链;若OD260/OD280<1.7,说明可能存在蛋白质的残留。质粒DNA的浓度计算公式:质粒DNA浓度(ug/ml)=A260*稀释倍数*50ug/ml/光程。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm