质粒的扩增和提取

关键词：质粒 细胞培养板 细胞培养瓶

(1)miR-203过表达质粒的扩增

①自-70℃冰箱中取出已转化了miR-203过表达质粒的感受态大肠杆菌，插入湿冰中溶解15min，轻轻混匀。吸取50ul移入1.5ml离心管中，剩余细菌放回-70℃冰箱。加入5ul质粒，轻轻混匀，静置冰上30min。

②于42℃水浴中热休克细菌45sec，迅速移入湿冰中，静置2min，加入900ul不含抗生素的LB液体培养基，放入37℃恒温箱摇床培养1h。取50ul涂于含氨苄青霉素的LB琼脂平板皿上，待干燥后，倒置，存放于37℃的培养箱中过夜。

③小摇：LB液体培养基中加入200ul氨苄青霉素储存液，混匀。取200ul含氨苄青霉素的LB液体培养基移入10ml的离心管中，挑取琼脂平板上单一菌落，接种到上诉LB培养液中，37℃恒温箱摇床培养8h。

④大摇：取200ml含氨苄青霉素的LB液体培养基移入250ml的锥形瓶中，取菌液200ul接种到LB培养液中，37℃恒温箱摇床培养24h。

(2）miR-203过表达质粒的提取按照鼎国的无内毒素质粒大提试剂盒的说明书，提取并纯化目的质粒，使用96孔UV板，将质粒稀释20倍（95ulDEPC水中加5ul质粒），用酶标仪测定质粒的吸光度A260和A280的值并计算质粒的纯度和浓度。

(3)质粒纯度和浓度的判定纯的质粒，1.8<=OD260/OD280<=1.9；若OD260/OD280>2，说明有RNA残留或DNA变性解链；若OD260/OD280<1.7，说明可能存在蛋白质的残留。质粒DNA的浓度计算公式：质粒DNA浓度（ug/ml）=A260*稀释倍数*50ug/ml/光程。

实验所需耗材：