关键词:蛋白免疫印迹 细胞培养板 细胞培养瓶

 

①选择大小合适的样品梳和厚度适宜的玻璃板,用双蒸水洗干净,放置片刻晾干;组装好电泳所用的玻璃板,双蒸水检漏完毕后,使用1000ul的移液枪加入配制好的分离胶到合适高度,并加入适量双蒸水压胶,室温放置30min。

②等到分离胶完全凝固、聚合之后,用移液枪吸除上层双蒸水,并用滤纸吸干残留的水分,加入配制好的浓缩胶后,立即插入样品梳,室温放置30min。

③等到浓缩胶完全凝固、聚合之后,将配置好的垂直电泳玻璃板放进电泳槽中,倒入适量的5x电泳缓冲液,缓慢、平衡拔出样品梳,连接好电泳装置,接通电源,恒压90V,电泳15min。

④取出蛋白样品并吸取需要的上样量,分别将准备好的蛋白marker及各组样品加入样品孔中,加入足量电泳缓冲液,连接电路,恒压90V电泳至溴酚蓝染料接近分离胶下缘时,结束电泳。

⑤预先用无水甲醇活化PVDF膜3min,并用4C°预冷的电转缓冲液浸没海绵、滤纸等电转用品15min。

⑥拆除电泳装置,切除凝胶上下左右多余部分至与PVDF膜相当大小,将凝胶转移至海绵-三层滤纸结构上,将PVDF膜小心覆盖在凝胶上,玻璃棒赶走膜与胶之间的气泡,再在其上小心覆盖三层滤纸-海绵,继续用玻璃棒轻轻滚动赶走气泡,扣紧上下夹,即成三明治结构。

⑦将制作好的转膜三明治结构装入电转槽中,加入预冷的电转缓冲液使其完全没过转膜三明治,接通电路,恒压100V,电转90min。

⑧转膜结束后,取出PVDF膜。

⑨将新配的封闭液倒入适宜的玻璃培养皿中,将PVDF膜放入封闭液中,室温封闭2h后,用TBST摇床上洗涤PVDF膜1次。

⑩根据需要对PVDF膜进行裁剪,将裁剪后的PVDF膜分别放到相应的抗体孵育盒的小格中,加入适量配制好的一抗工作液,使一抗工作液浸润膜的表面,4C°摇床上孵育过夜结束后,PVDF膜用TBST摇床上洗涤三次,每次5min。

⑪把PVDF膜分别放到相应的抗体孵育盒的小格中,加入适量配制好的二抗工作液,使二抗工作液浸润膜的表面,在摇床上室温孵育2h后,PVDF膜用TBST摇床上洗涤三次,每次5min。

⑫提前配制好ECL发光液2mL,将PVDF膜转移至ECL发光孵育盒中,加入发光液,使膜完全浸润。

⑬将发光孵育盒置于暗室中,放置胶片至孵育盒中,曝光30sec,取出胶片依次放入显影液及定影液中,直至胶片上蛋白条带清晰、背景干净为止。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

接种环

接种针

冻存管

冻存盒

程序降温盒

离心管

微量离心管

血清移液管

巴氏吸管

移液吸头

8连管

96孔板

封板膜

封板刮刀

 

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

细胞培养板平底TC处理无菌

耐思细胞培养皿35mm

耐思细胞培养皿60mm

耐思细胞培养皿100mm

耐思细胞培养皿1150mm

硕华细胞培养皿35mm

硕华细胞培养皿60mm

硕华细胞培养皿100mm

一次性培养皿

一次性细胞培养皿

无菌TC细胞培养皿

耐思玻底培养皿

硕华玻底培养皿

激光共聚焦培养皿

耐思玻底培养皿15mm

耐思玻底培养皿20mm

独立灭菌玻底培养皿

灭菌TC玻底培养皿

硕华玻底培养皿15mm

硕华玻底培养皿20mm