关键词:染料配基层析法 纯化 蛋白质 科进 Kirgen 爱思进 Axygen 康宁 corning 耐思 NEST 白鲨易 biosharp

 

实验方法原理
  选择纯化特异蛋白质的适宜染料一般是通过反复试验比较后决定。Cibacron Blue F3GA,作为该领域的先驱染料与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸很相似,并且一直用于纯化激酶、水解酶、聚合酶和其他核苷酸依赖的蛋白质。但是这种结合特异性不是绝对的,Cibacron Blue 也用于不具有核苷酸结合功能的各种蛋白质的纯化。蛋白质与染料的结合可能涉及疏水、静电或氢键结合力等。
  因此,尽管有市售的筛选各种染料的试剂盒,选择纯化给定蛋白质的最佳染料也没有现成的方法可楯。Scopes 按照与蛋白质结合的能力将染料分类,并推荐了一个选择最有效染料的系统。
  染料配基层析的操作比较简单。基于一些支持介质的染料层析柱填料可从市场获得,这些推荐的商品都有很好的可再生性。在选择适宜的染料配基时,非常实用的方法是连续进行几种染料配基层析试验,如果第一种不结合目的蛋白,也许第二种就会结合。洗脱时,绝大多数蛋白质是采用高盐方式洗脱,虽然后面还提及其他方法。染料配基柱若是与目的蛋白结合能力很有限,则可以降低溶液的pH值或应用二价、三价阳离子时常会得到改善。总之,遵循上述这样几个办法,染料配基层析将在蛋白质纯化中发挥重要作用。
 
实验材料
蛋白质样品液
 
试剂、试剂盒
Tris-HCl NaCl NaOH NaN3
 
仪器、耗材
层析柱
 
实验步骤
  在开始染料配基层析纯化蛋白质之前,必须确定所用的染料。如前所述,需用不同染料柱进行小规模(1 ml 柱)试验筛选。Scopes 推荐的策略可供参考。此外,进一步的小规模试验可用于优化洗脱参数。有必要提醒注意的是:一个能与许多蛋白质结合而不结合目的蛋白的染料配基柱非常有用。它可以作为最终纯化前去除杂蛋白的极佳步骤。以下介绍 Cibacron Blue F3GA 柱用高盐溶液洗脫的方案。
1. 用5 ml Cibacron Blue F3GA-琼脂糖装填一个层析柱。对大多数实际应用来讲,短而粗的柱子应能获得满意效果。长而细的柱子多用于纯化结合力弱的蛋白质,虽然流速会有所下降;
2. 10 倍柱床体积的层析缓冲液(例如,20 mmol/L,pH 8.0 Tris-HCl,0.1 mol/L NaCl) 平衡装好的柱子;
3. 为了达到上样要求,蛋白质样品液需转换成近似层析缓冲液的条件,即通过用层析缓冲液透析或 1:1 稀释来进行。上样前样品液应经离心或过滤达到澄淸。5 ml 柱子能上样 50~200 mg 蛋白质样品。除非蛋白质结合容量非常高,通常上样蛋白质浓度应在 10~20 mg/ml 范围;
4. 上样到层析柱;
5. 5 倍柱床体积层析缓冲液洗柱或洗至 A280 值回到基线;
6. 5 倍柱床体积洗脱缓冲液(例如,20 mmol/L,pH 8.0 Tris-HCl,0.1 mol/L NaCl) 洗脱目的蛋白;
7. 检测洗脱组分中的目的蛋白,并汇集含活性目的蛋白的组分;
8. 再生层析柱。先用 3 倍柱床体积 1 mmol/L NaOH洗柱,再用 10 倍体积含 0.02% NaN3 的层析缓冲液洗柱即可。
 
 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

阿拉丁

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁

耐思

伯乐

硕华

皎洁

密理博

创博环球

碧云天

新星

白鲨易

科进

卧宏生物

爱思进

科晶

肖特

离心管

八排管

移液管

程序降温盒

免疫组化笔

滤芯吸头

巴氏吸管

加样槽

冻存盒

细胞冻存管

酶标板

载玻片

封口膜

移液器

细胞计数板

PCR板

细胞刮刀

接种针

细胞培养小室

细胞滤网

透析袋

乳胶手套

ELISA

血清

抗体

雷磁

求精

广州洁特

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏

金佰利

科默斯

武汉华美生物

其林贝尔

Biofroxx

Pall

爱马斯

麦迪康

世泰

Parafilm

古洛玻璃

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD