关键词:基因SOEing PCR突变 细胞培养板 细胞培养瓶 细胞培养皿 玻底培养皿 玻底培养板

 

试剂、试剂盒
无菌 H2O PCR 缓冲液 限制性酶和缓冲液 Taq DNA 聚合酶 PCR 模板 5'和 3'引物 dNTP
 
仪器、耗材
DNA 测序装置 热循环仪 琼脂糖凝胶电泳设备
 
实验步骤
一、材料
 
1. 缓冲液、溶液和试剂
 
无菌 H2O
 
2. 酶和酶缓冲液
 
10XPCR 缓冲液(Roche),包含 100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/L,KCl 和 15 mml/LMgCl2
 
限制性酶和缓冲液
 
Taq DNA 聚合酶(Roche)
 
3. 核酸和寡核苷酸
 
10X dNTP, 商品出售的 dNTP 溶液(AmershamBiosciences) 是 100umol/L 浓度的储存液,可以用无菌水稀释。
 
PCR 模板
 
5'和 3'引物
 
4. 特殊设备
 
DNA 测序装置
 
热循环仪
 
5. 其他
 
琼脂糖,分离 DNA 片段所需的琼脂糖浓度依赖于需要分离的片段的大小。依经验,0.8%~1% 的 SeaKem GTG 琼脂糖(Cambrex)(用 1XTAE 配制)一般都能够令人满意地分离 0.25~2kb 大小的 DNA 片段。
 
琼脂糖凝胶电泳设备
 
GENECLEANⅡ试剂盒(BIO101)
 
6. 载体和菌株
 
PCR 产物测序所需的克隆载体和菌株。
 
二、方法
 
1. 通过重叠延伸进行 PCR 突变
 
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应生成产物 AB 和 CD(参见图 32-1)。这些反应混合物能够在室温下混合。
 
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min, 72℃ 2 min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 AB 和 CD),用 GENECLEANUⅡ试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个新的微量离心管中进行重叠延伸反应。
 
 
这一反应对于加入的模扳量不十分敏感。通常每种模板可以使用 10~100ng。引物 a 和 d 也可以在PCR 反应的开始就加入。
 
(6)参照上面的步骤 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 AD),参照步骤 4 回收 DNA片段。
(8)纯化的突变产物 AD 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。
 
2. 基因 SOEing
(1)在独立的微量离心管中进行 PCR 反应,以分别产生来自基因 1 的产物 WX 和来自基因 2 的产物 YZ(图 32-2)。
(2)反应进行 30 个循环(94℃ 1min, 50℃ 1min,72℃ 2min)。
(3)将每个反应的所有反应物进行琼脂糖凝胶电泳。
(4)切下目标条带(即产物 WX 和 YZ), 用 GENECLEANB 试剂盒回收 DNA 片段。
(5)在一个微量离心管中进行 SOEing 反应。
(6)参照上面的步驟 2 进行 PCR 扩增。
(7)将反应物进行琼脂糖凝胶电泳,切下目标条带(即产物 WZ), 参照步骤 4 回收 DNA 片段。
(8)纯化的突变产物 WZ 随后可以被适当的限制性酶所消化,然后连接到一个合适的克隆载体上进行后续的转化和测序。
 
 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD

碧云天

阿拉丁

索莱宝

天恩泽

诺博莱德