关键词:蛋白质凝胶电泳 凝胶 细胞培养板 细胞培养瓶 细胞培养皿 玻底培养皿 玻底培养板

 

实验方法原理
将蛋白质样品同离子型去垢剂十二烷基硫酸钠(SDS)以及硫基乙醇一起加热,使蛋白质变性,多肽链内部的和肽链之间的二硫键被还原,肽链被打开。打开的肽链考疏水作用与SDS结合而带负电荷,电泳时在电场作用下,肽链在凝胶中向正极迁移。不同的肽链由于在迁移时受到的阻力不同,在迁移过程中逐渐分开,其相对迁移率与分子量的对数间成线性关系。
 
实验材料
丙烯酰胺
 
试剂、试剂盒
去离子水 SDS 浓盐酸 Tris 过硫酸胺 TEMED 甘氨酸
 
仪器、耗材
电泳槽 电泳仪 加样器 吸头
 
实验步骤
1.  根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板,确定需配制分离胶的浓度和体积,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液”所列成分(见书末附录)配制所需分离胶;
2.     迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中,留出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加1cm,用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS(当丙烯酰胺浓度≤8%时)或异丁醇或水(当丙烯酰胺浓度≥10%时),覆盖层可防止氧扩散进入凝胶而抑制聚合反应。将凝胶垂直置于室温下;
3.    分离胶聚合完全后,倒出覆盖层液体,用去离子水洗涤凝胶顶部数次以除去未聚合的丙烯酰胺,尽可能排除凝胶上的液体;
4.    确定需配制浓缩胶的体积,按“配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液”(见书末附录)配制所需浓缩胶,然后直接将浓缩胶灌注在分离胶上,立即插入干净的配套梳子,避免气泡,然后加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙。待浓缩胶聚合后,拔出梳子,形成加样孔;
5.    用去离子水将Tris-甘氨酸电泳缓冲液贮存液稀释5倍,倒入电泳槽,将加样孔充满,这时加样孔中的气泡可通过电泳缓冲液排除。
 
注意事项
1. 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶称、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;剥胶时凝胶板易断裂,为防止引现象,所用器材均应严格地清洗。硅橡胶条的凹槽、样品槽模板及电泳槽用泡沫海绵蘸取“洗洁净”仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h或0.2mol/L KOH的酒精溶液中20min以上,用清水洗净,再用泡沫海绵蘸取“洗洁净”反复刷洗,最后用蒸馏水冲洗,直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
2. 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力旋紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽板梳齿应平整光滑。
3. 在不连续电泳体系中,预电泳只能在分离胶乡合后进行。洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后,不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
4. 电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压,过高或过低无可影响电泳效果。
5. SDS纯度:在SDS-PAGE中,需高纯度的SDS,市售化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下:称20g SDS放在圆底烧瓶中,加300ml无水乙醇及约半牛角匙活性碳,在烧瓶上接一冷凝管,在水浴中加热至乙醇微沸,回流约10min,用热布氏漏斗趁热过滤。滤液应透明,冷却至室温后,移至-20℃冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤,再用少量-20℃预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次,尽量抽干,将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40℃以下的烘箱中烘干。
6. 用SDS处理蛋白质样品时,每次都会在沸水溶中保温3——5min,以免有亚稳聚合物存在。
7. 标准蛋白质的相对迁移率最好在0.2——0.8之间均匀分布。值得指出的是,每次测定未知物分子量时,都应同时用标准蛋白制备标准曲线,而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量,而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围,最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好,对糖蛋白,胶原蛋白等分子量测定差异较大。
8. 对样品的要求:应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高,则应透析或经离子交换除盐。加样时,应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15μl为宜,如样品系较稀的液体状,为保证区带清晰,加样量可增加,同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。
9. 由于凝胶中含SDS,直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板,则用25%异丙醇内含7%乙酸浸泡,并经常换液,直到SDS脱尽(约需2-3天),才可制备干板。为方便起见,常采用照像法,保存照片。
 
其他
不连续聚丙酰胺凝胶电泳包含两种不同缓冲液成分、ph值和凝胶孔径,而且在电泳过程中形成的电位梯度均不同,由此产生了浓缩效应、电荷效应和分子筛效应:
(1)浓缩效应:样品在开始电泳时,通过浓缩胶浓缩成高浓度的样品薄层;
(2)电荷效应:在均一电势梯度和PH的分离胶中,由于各蛋白质的等电点不同所带电荷量不同,在电场中所受到的引力不同,经过一段时间的电泳,各种蛋白质就以一定顺序排列成一条条蛋白质区带;
(3)有分离胶孔径较小,分子量大小和分子形状不同的蛋白质通过分离胶后,所受的阻滞程度不同,因而迁移率不同而被分离。
 
 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD

碧云天

阿拉丁

索莱宝

天恩泽

诺博莱德