关键词:AnnexinV-FITC 细胞凋亡 碧云天 阿拉丁 索莱宝 天恩泽 诺博莱德

 

1.对于悬浮细胞:
a.在进行完细胞凋亡刺激后,1000g离心5分钟,弃上清,收集细胞,用PBS轻轻重悬细胞并计数。注意:PBS重悬不能省
略,PBS重悬的过程同时也起到了洗涤细胞的作用,可以保证后续AnnexinV-FITC的结合。
b.取5-10万重悬的细胞,1000g离心5分钟,弃上清,加入195µlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。
c.加入5µlAnnexinV-FITC,轻轻混匀。
d.加入10µl碘化丙啶染色液,轻轻混匀。
e.室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟,随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。
f.如果用于流式细胞仪检测,可立即上机检测,AnnexinV-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光,流式检测细胞凋亡的效果及其验证请参考图1和图2。初次进行流式细胞仪检测时,建议选择一组适当的细胞参考图2设置未染色、PI单染和AnnexinV-FITC单染这3个对照。如果用于荧光显微镜检测,1000g离心5分钟,收集细胞,用50-100µlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞,涂片后,荧光显微镜下观察。注意:细胞在染色后须尽快完成检测,通常宜在1小时之内完成检测。用于流式细胞仪检测时,如果发现AnnexinV-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞,并且通过调整相关设置和参数也无法改善,可以用PBS将AnnexinV-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
2.对于贴壁细胞的消化后检测:
a.把细胞培养液吸出至一合适离心管内,PBS洗涤贴壁细胞一次,加入适量胰酶细胞消化液(可含有EDTA)消化细胞。室温
孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时,吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。注意:对于贴壁细胞,胰
酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,从而导致细胞坏死
的假阳性;消化时间如果过长,同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与
AnnexinV-FITC的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时,胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA,因为EDTA可能会影响AnnexinV与磷脂酰丝氨酸的结合。
b.加入步骤2a中收集的细胞培养液,把细胞轻轻吹打下来,转移到离心管内,1000g离心5分钟,弃上清,收集细胞,用PBS
轻轻重悬细胞并计数。注意:加入步骤2a中的细胞培养液非常重要,一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,
另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解后续加入的AnnexinV-FITC,
导致染色失败。
c.取5-10万重悬的细胞,1000g离心5分钟,弃上清,加入195µlAnnexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。
d.加入5µlAnnexinV-FITC,轻轻混匀。
e.加入10µl碘化丙啶染色液,轻轻混匀。
f.室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟,随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染
色效果。
g.如果用于流式细胞仪检测,可立即上机检测,AnnexinV-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光,流式检测的效果及
其验证请参考图1和图2。如果用于荧光显微镜检测,1000g离心5分钟,收集细胞,用50-100µlAnnexinV-FITC结合液轻
轻重悬细胞,涂片后,荧光显微镜下观察。注意:细胞在染色后须尽快完成检测,通常宜在1小时之内完成检测。用于
流式细胞仪检测时,如果发现AnnexinV-FITC单独染色时出现了过多的PI假阳性细胞,并且通过调整相关设置和参数也
无法改善,可以用PBS将AnnexinV-FITC稀释3-10倍后再进行检测。
3.对于贴壁细胞的原位荧光检测:
注:本方法的优点是可以原位观察细胞凋亡,缺点是部分凋亡由于不贴壁而检测不到。
a.(选做)如果条件许可,把细胞培养于24孔板、48孔板或96孔板内。在凋亡诱导结束后,用可以对多孔板进行离心的离心
机1000g离心5分钟。
b.吸除细胞培养液,加入PBS洗涤一次。如果条件许可,在吸除PBS前1000g离心5分钟。
c.加入195µlAnnexinV-FITC结合液。
d.加入5µlAnnexinV-FITC,轻轻混匀。
e.加入10µl碘化丙啶染色液,轻轻混匀。
f.室温(20-25ºC)避光孵育10-20分钟,随后置于冰浴中。可以使用铝箔进行避光。
g.随即在荧光显微镜下观察,AnnexinV-FITC为绿色荧光,碘化丙啶(PI)为红色荧光。注意:细胞在染色后须尽快完成检测,通常宜在1小时之内完成检测。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD

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