关键词:PCR引物设计 碧云天 阿拉丁 索莱宝 天恩泽 诺博莱德

 

PCR引物设计的黄金法则
1.  引物最好在模板cDNA的保守区内设计。
DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。

2.引物长度一般在15~30碱基之间。
引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。

3.引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好接近72℃。
GC含量(composition)过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(meltingtemperature)是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值,则有效引物的Tm为55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。

4.引物3′端要避开密码子的第3位。
如扩增编码区域,引物3′端不要终止于密码子的第3位,因密码子的第3位易发生简并,会影响扩增的特异性与效率。

5.引物3′端不能选择A,最好选择T。
引物3′端错配时,不同碱基引发效率存在着很大的差异,当末位的碱基为A时,即使在错配的情况下,也能有引发链的合成,而当末位链为T时,错配的引发效率大大降低,G、C错配的引发效率介于A、T之间,所以3′端最好选择T。

6.碱基要随机分布。
引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错误引发(Falsepriming)。降低引物与模板相似性的一种方法是,引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C,因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。

7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。
引物自身不应存在互补序列,否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。
两引物之间也不应具有互补性,尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体(Dimer与Crossdimer)的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话,应尽量使其△G值不要过高(应小于4.5kcal/mol)。否则易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。

8.引物5′端和中间△G值应该相对较高,而3′端△G值较低。
△G值是指DNA双链形成所需的自由能,它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,△G值越大,则双链越稳定。应当选用5′端和中间△G值相对较高,而3′端△G值较低(绝对值不超过9)的引物。引物3′端的△G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。(不同位置的△G值可以用Oligo6软件进行分析)

9.引物的5′端可以修饰,而3′端不可修饰。
引物的5′端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。
引物的延伸是从3′端开始的,不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能。

10.扩增产物的单链不能形成二级结构。
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响,选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关软件(比如RNAstructure)可以预测估计mRNA的稳定二级结构,有助于选择模板。实验表明,待扩区域自由能(△G°)小于58.6lkJ/mol时,扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时,用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。

11.引物应具有特异性。
引物设计完成以后,应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性,就可以进行下一步的实验了。

 

POSTbyBingsenXu

前言:我是刚刚注册到丁香园,在PCR技术讨论版看见置顶贴,“请求助引物设计的战友先进来这里!”稍微浏览了一下,发现很多朋友对PCR引物设计还不是很熟悉,我愿意把自己积累的一点引物设计方面的经验和大家分享,希望不会做引物设计的朋友看完之后,可以不用再发求助贴而是自己动手做引物设计或者引物检验。

开始之前:其实非常简单,不需要你下载任何软件,但是你得有一台电脑能上网。当然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本贴的讨论范围。另外,要先对PCR目的序列的长度有个大致估计,好了,马上开始吧:
第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是http://frodo.wi.mit.edu/。
第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(附件Word文档里有图)在“Pastesourcesequencebelow(5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。
第三步:重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。
第四步:Pickprimers:点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看Primer3Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还有primer本身的信息,包括位置,长度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),还有产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。
比如(随便举例,本人在做一个超长引物):
WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stability
OLIGOstartlentmgc%any3'seq
LEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC
RIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT
SEQUENCESIZE:1388
INCLUDEDREGIONSIZE:1388
PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00
第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一向引物,只要在Pickleftprimer或者Pickrightprimer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'->3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,我将抽空另做说明。
至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到PCR一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。最后,GOODLUCKTOEVERYONE.

手把手教你在线做PCR引物设计

POSTbyBingsenXu

 

开始之前:其实非常简单,不需要你下载任何软件,但是你得有一台电脑能上网。当然,最重要的是,你要很清楚用于做引物的模板序列,至于怎么找模板序列,不再本贴的讨论范围。另外,要先对PCR目的序列的长度有个大致估计,好了,马上开始吧:

第一步:找到Primer3的站点。你不用记住这个站点,但是要记住“Primer3”这个词,然后打开GOOGLE首页,输入Primer3,跳出来的第一个项目就是了“Primer3Input0.4.0(primer3-web/htdocs/input-040.htm)”网址是http://frodo.wi.mit.edu/

第二步:贴上模板序列。进入Primer3站点,可以看到一个引物设计的界面。(附件Word文档里有图)在“Pastesourcesequencebelow(5'->3'…..”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是5'->3'方向的,数字或者空格都没关系,软件会自动过滤的。

第三步:重要参数设定。首先是“ProductSizeRanges”,如果你不希望软件给你随便做的话,首先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000,这个你得自己改,如果你希望产物的大小符合你的预期,尽可能把范围改小,比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是“PrimerSize”,默认值一般可以用,但是,当你用熟了这个软件,你自己就知道该怎么改了。第三个参数是”PrimerTm”这个和PrimerSize差不多。

第四步:Pickprimers:点一下这个按钮,符合你大小预期的primer就出来了,看看Primer3Output的界面,多么漂亮!你要的primer出来了,而且有primer在序列上的位置比对图,还要primer本身的信息,包括位置,长度,Tm,GC含量,任何位置互补碱基数,3'端互补碱基数,以及引物序列,(注意,下游引物是5'->3'),还要产物大小,两引物间任意互补碱基数,两引物间3'端互补碱基数等。如果引物尚在参数设定的范围内,但还不是最佳,将会给出警告。

比如(随便举例,本人在做一个超长引物):

WARNING:Leftprimerisunacceptable:High3'stability

OLIGOstartlentmgc%any3'seq

LEFTPRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCC

RIGHTPRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACAT

SEQUENCESIZE:1388

INCLUDEDREGIONSIZE:1388

PRODUCTSIZE:1388,PAIRANYCOMPL:5.00,PAIR3'COMPL:3.00

第五步:引物设计检验:可以仅仅设计一向引物,只要在Pick left primer或者Pick right primer前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物,放在Primer框里,(注意,下游引物的书写反向仍然是5'->3')如果符合设定的条件,软件将对给出引物评分,同时给出警告信息,根据警告信息可以适当对自定义引物做些调整即可,警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物,最好都要检查一下,这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物,最好是使得产物跨过内含子,这样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候,要把内含子都去掉,仅仅把外显子序列放入源序列框中,并且通过自定义引物设计的方法,使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,我将抽空另做说明。

至于设计出来的引物的实际效果,根据我的经验,一般情况下都能做到PCR一次成功,也许随便那一段序列做引物也能达到很好的效果,但是不管怎么说,软件做引物可以让自己心中有数。最后,GOODLUCKTOEVERYONE.

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD

碧云天

阿拉丁

索莱宝

天恩泽

诺博莱德