制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法实验(制备超级感受态细胞)

关键词:转化感受态大肠杆菌 Inoue 超级感受态细胞 碧云天 阿拉丁 索莱宝 天恩泽 诺博莱德

 

【摘要】采用Inoue的方法(1990)制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法(1980)的转化效率。但在标准的实验室条件下,达到1X108~3X108个转化克隆/μg质粒DNA的转化效率更为常见。与Hanahan方法相比,这一方法的优点在于并不过分地讲究细节,但是重复性更好,而且更有预见性。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

【内容】制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法实验(制备超级感受态细胞)

 

实验方法原理

采用Inoue的方法(1990)制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法(1980)的转化效率。但在标准的实验室条件下,达到1X108~3X108个转化克隆/μg质粒DNA的转化效率更为常见。与Hanahan方法相比,这一方法的优点在于并不过分地讲究细节,但是重复性更好,而且更有预见性。

 

实验材料

质粒DNA

 

试剂、试剂盒

二甲亚砜DMSOInoue转化缓冲液

 

仪器、耗材

SOB琼脂板SOC培养基SorvallGSA转头或与之相当的转头液氮聚丙烯离心管水浴

 

实验步骤


一、材料

1.缓冲液和溶液(1)二甲亚砜DMSO二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚,是转化的抑制物(Hanahan1985)。为避免上述问题,应购买高质量的DMSO。(2)Inoue转化缓冲液用前置于冰上预冷至0℃。

2.核酸和寡核苷酸质粒DNA(重组质粒)

3.培养基

(1)LB或SOB培养基(培养最初的细菌生长物)

(2)SOB琼脂板,含20mmol/LMgSO4和适当的抗生素。标准的SOB琼脂板含10mmol/LMgSO4。

(3)SOB培养基(培养转化的细菌)培养前,准备3个内盛250ml18~20℃SOB的1L锥形瓶。

(4)SOC培养液每个转化反应约需1ml。

4.离心机和转头SorvallGSA转头或与之相当的转头

5.专用设备液氮,聚丙烯管,18℃摇床,温度可调42℃的水浴装置。


二、方法

1.制备感受态细胞(1)准备Inoue转化缓冲液(用前冰上预冷)。

①0.5mol/L的PIPES(pH6.7)[哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)]溶液的配制:将15.1gPIPES溶于80ml水中(Milli-Q级,或与之相当级别的),用5mol/LKOH调pH值至6.7,最后加纯水,定容至100ml。用预先处理的Nalgene滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌。分成小份于-20℃保存。

②Inoue转化缓冲液的配制:将下列组分溶于800ml纯水中,然后加20ml0.5mol/LPIPES(pH6.7),然后加20ml0.5mol/L的PIPES(pH6.7),加纯水定容至1L。

③用预先处理的Nalgene滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌。分成小份于-20℃保存。

(2)挑取一个经37℃培养16~20h平皿上的单菌落(2~3mm直径),接种至250ml锥形瓶中的25mlLB培养液或SOB培养液中,37℃摇床(250~300r/min)培养6~8h。

(3)晚上约6点钟,将上述初始培养物接种于三个盛有250mlSOB培养液的1L锥形瓶中,第一个加10ml,第二个加4ml,第三个加2ml,于18~22℃中速摇床过夜。

(4)次日早上,测量三瓶培养物的OD600值,每45min测定一次。

(5)当有一瓶的培养物OD600=0.55时,将培养瓶置于冰上10min,弃去另两瓶培养物。由于大多数实验室的昼夜温差较大,而且温差也随一年四季及工作人员数的变化而变化。因此,很难预测合适OD值的时期,尤其是晚上同时培养三瓶不同浓度梯度的菌液,可以提高成功的机会,培养过夜的菌液至少有一瓶是符合要求的。

(6)于4℃以2500g(相当于SorallGSA转头,900r/min)离心10min收集菌体。

(7)倒去培养液,将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体,用一个真空吸引器将贴附在管壁上的培养基吸干。

(8)加80ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。轻轻旋转,不要用振荡器或吹吸混匀。

(9)于4℃2500g(相当于SorallGSA转头3900r/min)离心10min收集菌体。

(10)倒去上层培养液,将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体,用一个真空吸引器将附在管壁上的培养基吸干。

2.冻存感受态细胞

(1)用20ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀。

(2)加1.5mlDMSO。轻轻混匀细菌悬液,放置冰上10min。

(3)迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中,封紧管口,没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃ 备用。

(4)需要时冰箱中取出一管感受态细胞,把管握于手心,融化细胞。细胞一经融化,立即把管转移至冰浴中,在冰上放置10min。

(5)用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管(17X170mm)中,放置在冰浴上。不用玻璃管是因为它们会降低转化效率约10倍。

3.转化包括阳性和阴性对照。

(1)将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需25ngDNA),体积不应超过感受态细胞的5%,轻轻旋转几次混匀内容物。实验中至少设对照管:一个含有感受态细胞和已知量的超螺旋质粒DNA,另一管只有感受态细胞。混匀内容物,冰浴30min。

(2)将管放入预加温至42℃的循环水浴中,恰恰放置90s,不要摇动。热激是一个关键步骤,准确地达到热激温度非常重要。这里的温度及温育的时间都是使用Falcon2059管的测量参数,其他类型的管将可能获得不同的结果。

(3)快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1~2min。

(4)每管加800μlSOC培养基,用水浴将培养基加温至37℃,然后将管转移到设置为37℃的摇床上,温育45min,使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高转化率,复苏期中应温和地摇动细胞(<225r/min)。如果带有α互补,请接“用X-gal和IPTG筛选细菌菌落:α互补”。

(17)将适当体积(每个90mm平板达200μl)已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO4和相应抗生素的SOB培养基上。如果用四环素作为选择标记,全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或软琼脂中),可以先在微量离心机上室温离心20s以收集转化菌,在轻拍管壁的同时加入100μlSOC重悬沉淀。重要:玻璃铺菌器先需在乙醇中浸泡,然后在酒精灯上灼烧,待它凉至室温后,才可将转化菌轻轻地铺在琼脂板表面。如检査氨芐青霉素的抗性,用转化菌铺平板时密度应较低(每个90mm平板不超过104菌落),于37℃培养的时间不超过20h。氰苄青霉素抗性的转化体可将β-内酰胺酶分泌到培养基中,迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样,铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氰苄青霉索敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素,以及将抗生素浓度从60 μg/ml提高到100μg/ml,可使情况有所改善,但不能彻底根除之。抗氨芐青霉素菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系,这可能是因为被抗生素杀死的细胞释放生长抑制物质的缘故。

(18)将平板置于室温直至液体被吸收。

(19)倒置平皿,于37℃培养,12~16h后可出现菌落。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金

Gibco

CST

Santa

DSHB

GeneTex

Thermo

Novus

lifespan

millipore

RD

碧云天

阿拉丁

索莱宝

天恩泽

诺博莱德