单链构象多态性和异源双链分析方法检测突变实验

关键词：单链构象多态性 异源双链 突变 碧云天 阿拉丁 索莱宝 天恩泽 诺博莱德

【摘要】险测突变的目的主要是为弄懂人类遗传性疾病的分子机制，以便有效的针对这些疾病进行预防、诊断和治疗，但更多的是用于分析不同生物体基因型与表型之间的关联。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔。

【内容】单链构象多态性和异源双链分析方法检测突变实验

试剂、试剂盒

扩增缓冲液dNTP混合溶液甲酰胺上样缓冲液蔗糖凝胶缓冲液TBE电泳缓冲液限制性内切酶热稳定DNA聚合酶人类基因组DNA正向引物和反向引物[a-32P]dCTP丙烯酰胺双丙烯酰胺过硫酸胺甘油TEMED
 

仪器、耗材

带屏障装置的自动移液器吸头沸水浴电泳板、破璃和0.4mm隔条干胶设备玻璃毛细管Hamilton注射器微量离心管可调式移液器热循环仪水浴Whatman3MM滤纸
 

实验步骤


材料

缓冲液和溶液贮存液，缓冲液和试剂的成分请参阅附录1。将贮存液稀释到合适的浓度。10x扩增缓冲液含4种dNTP,每种浓度为1mml/L(PH7.0)的dNTP混合溶液（PCR级）甲酰胺上样缓冲液蔗糖凝胶缓冲液（缓冲液类型I)10XTBE电泳缓冲液用1X工作强度的TBE(89mmol/LTris-硼酸盐，2mmol/LEDTA)进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。1xTBE浓度能提供必需的缓冲能力。缓冲液的PH值一般应为8.3。通常不需要调节pH值，然而当使用实验室新制备的10XTBE缓冲液时，应检査pH值变化。用同一种10XTBE贮存液制备凝胶和跑胶缓冲液。离子强度和pH值的微小变化将产生缓冲液对抗。使DNA带型发生极大的扭曲。酶和缓冲液限制性内切酶（选用）热稳定DNA聚合酶推荐使用TaqDNA聚合酶核苷酸和寡核苷酸用于筛选点突变的人类基因组DNA将DNA以10ug/ml在TE(pH7.6)缓冲液中。寡核苷酸引物包括正向引物和反向引物（每种浓度为35umol/L)溶在TE中(pH7.6)放射性物质[a-32P]dCTP(3000Ci/mmol,10mCi/ml)凝胶丙烯酰胺：双丙烯酰胺（29:1;m/V)许多研究者使用商业化的预制丙烯酰胺和双丙烯酰胺溶液（例如.AcrylogelBDH）。然而，使用Hydrolink系列凝胺基质（Molinarifetal.1993)可获得最好的分辨率，它的商业化名称是MDE(MutationDetectionEnhancement),产品是由FMC生物制品公同（Rockland,Maine)制造。过硫酸胺（10%w/V)甘油使用高纯度级别的甘油，例如超纯的（LifeTechnologies)。请见关于甘油的信息栏。TEMED(四甲基乙二胺）许多厂商.包括Sigma公司和Bio-Rad公司出售电泳级的TEMED。TEMED易吸湿，应贮存在密封的容器中，4°C温度下保存。TEMEU的作用是辅助催化丙烯酰胺聚合。专用设备带屏障装置的自动移液器吸头沸水浴电泳板、破璃（两块40cmX40cm的玻璃）和0.4mm隔条。干胶设备玻璃毛细管（拉长）或带凝胶上样吸头的微量移液器Hamilton注射器或巴斯德移液器微量离心管（扩增闬0.5ml薄壁管）可调式移液器能够按扩增方案设定程序的热循环仪如果热循环仪不带加热盖装置，使用轻矿物油或石蜡防止PCR过程中反应混合物的液体挥发。限制性内切核酸酶消化所需温度的水浴Whatman3MM滤纸
 

方法

扩增用于筛选点突变的DNA

1.按顺序在一个消毒的离心管中混合下列成分:1mmol/LdNTP溶液                1ul10x扩增缓冲液                                      2ul35umol/L5'-寡核苷酸溶液                     1ul35umol/L3'-寡核苷酸溶液                     1ul10uCi/ul[a-32Pld-CTP                            1ul人的基因组DNA                  10ul(100ng)热稳定DNA聚合酶                                1~3单位加水至20ul在PCR过程中[a-32P]dCTP被均勻地结合并标记到扩增的DNA中。用32P标记的寡核苷酸引物代替[a-32P〕dCTP产生末端标记的DNA。如果可能，设置二组已知的在等位基闲序列上含有个或多个碱基不同的而且已知在SSCP胶上能够分辨出来DNA样品作为对照。

为避免发生污染需另外设置一个不加模板DNA的阴性对照

2.如果热循环仪不带加热盖装置，加入1滴（约50ul)轻矿物油覆盖反应混合物以防止在反复加热和冷却循环过程中样品蒸发。若使用热启动程序，可在管中加入一滴石蜡油。将反应管置于热循环仪中。

3.按下列表中列出的变性、退火、聚合时间和温度进行扩增。热循环参数的设定请参考第8章方案I。上述反应条件适合于50ul反应体积、0.5ml薄壁管和Perkin-Elmer9600、9700，MasterCyder(Eppendorf)或PTC100(MJResearch)热循环仪。使用其他类型的仪器或不同的反应体积时需调整上述反应条件。

制备SSCP凝胶

4.当开始PCR反应时，用含10%(V/V)甘油的lxTBE缓冲液制备5.5%的聚丙烯酰胺凝胶。10XTBE凝胶缓冲液                                             10ml29:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺溶液                            18ml10%过硫酸胺                            0.5ml甘油                                    10ml加水至                                  61.5ml溫和搅动以混合以上试剂。上述体积的溶液足够灌制一块标准大小（40cmX40cm）垫片厚度为0.4mm的凝胶。可增加或降低凝胶溶液体积制备所需大小的凝胶。用相同的10XTBE贮存液制备足以填满凝胶电泳装置的1XTBE凝胶缓冲液。

5.把两快40cmX40cm玻璃电泳板和0.4mm垫片装配并沾合在一起。为了获得单链DNA构象异构体的最大分辨率，应使用凝胶厚度等于或小于0.4mm的垫片。

6.加入100ulTEMED溶液，温和摇晃三角瓶，混合溶液并灌制凝胶。丙烯酰胺溶液聚合速度很快，因此操作要迅速，灌制薄胶的方法请见第12章方案8。

7.室温下把已经聚合的凝胶放到电泳装置中。电泳糟中加满与制备凝胶缓冲液相同的1XTBE缓冲液。

制备SSCP电泳样品

8.(可做可不做）当PCR反应结束时取出反应管置于冰上，若扩增DNA片段需要用限制酶消化，设置下列酶切反应PCR溶液                                                         5ul限制性缓冲液                          4ul限制性内切酶(2~50单位）                             2ul水                                                                     29ul在适合限制酶消化的溫度下孵育1~2h。

9.用蔗糖凝胶上样缓冲液将1.5ul原始PCR产物（步骤3)或5ul限制酶消化的PCR产物（步骤8)稀释至20ul。用甲酰胺染料混合物将相同量的样品稀释至20ul。用甲酰胺染料混合物稀释的样品将被变性，而用蔗糖凝胶缓冲液稀释的样品保持双链用作对照。

10.将含甲酰胺的样品煮沸6min,然后直接把反应管插入冰中。

SSCP凝胶电泳分离和分析DNA片段

11.使用巴斯德滴管或汉密尔顿注射器吸取1XTBE缓冲液冲洗聚丙烯酰胺凝胶的加样孔。用一个拉长的玻璃毛细管或带有凝胶上样吸头的微量移液器分別取2ul样品加到聚丙烯酰胺凝胶电泳上。

12,使用电压为6~7V/cm[约250V(和15mA)对于40cmX40cm凝胶]，电泳14h。

13.电泳完成后，分离玻璃板，将凝胶转移至1层Whatman3MM滤纸上，真空干燥30~60min。

14.对干凝胶进行放射自显影，在无增感屏的情况下室温曝光4~16h。非变性PCR样品（即，用蔗糖凝胶上样缓冲液稀释的样品）以双链DNA的形式在凝胶中迁移。相比之下，变性样品（即与甲酰胺染料混合物混合并进行煮沸的样品）将以双链和单链混合物的形式在凝胶中迁移。单链DNA通常在丙烯酰胺凝胶中的迁移率低于双链分子（MajwmandGilbert1977，1980;Szalayetal.1977)。在两条DNA互补链折叠形成的抅型不能被SSCP分辨的情况下，有-条单链条带能被检测到。如果互补链折叠成可以分辨的构型.两条链都能被检测到。二倍体生物的杂合等位基因的PCK产物产生至少4条带，两条带与野生型迁移率相同，另外两条带为特异的突变体。然而、往往会出现多于两条带的情况，既可能是样品遗传非均一性的结果，也可能是由于同一DNA分子的两条互补链自身折叠形成了多于一种形态的构象。带型相当复杂，而且很难从DNA序列、碱基组成和片段的长度来推算。然而，对于一种特定的诱变通常会有一种具有特征的带型。