双脱氧法DNA测序实验

发布时间:2021-06-23 浏览次数: TAG: 双脱氧 DNA测序 merck abcam 生工生物 天根生化 全式金

关键词:双脱氧 DNA测序 merck abcam 生工生物 天根生化 全式金

 

【摘要】在基本的双晩氧测序反应中,寡核苷酸引物退火于单链DNA摸板,在4种脱氧核糖核酸三磷酸存在时,引物为DNA聚合酶所延伸。反应混合物中也含有4种双脱氧核糖核苷三磷酸的其中一种,当它掺入到DNA的生长链时,可终止链的延伸。

【内容】测序酶进行标记测序反应α-标记核苷酸进行热循环测序反应

实验材料

DNA

 

试剂、试剂盒

寡核苷酸引物测序酶终止混合液测序酶缓冲液焦磷酸酶混合液

 

仪器、耗材

离心机离心管微量滴定板

 

实验步骤

1. 对于每个单链模板:将下列试剂混合于0.5ml微量离心管中(1)0.5pmol单链DNA模板(2)0.5pmol引物(3)1μl10×测序酶缓冲液(4)加水至10μl(5)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡)。于65℃温育6min,然后于37℃温育20min,转到步骤3。

2. 对于每个双链DNA模板:以下列混合液重溶含0.5pmol变性双链模板的干燥沉淀物。(1)1pmol引物(2)1μl10×测序酶缓冲液(3)加水至10μl(4)用吸管上下抽吸轻轻混匀(避免产生气泡),于37℃温育30min,然后在此退火温度下放置直至进行步骤3。 

3. 当引物正和模板退火时,对应每个待测模板,分别标记好A、C、G、T4个微量离心管。 DNA测序用酶的特性 3. 分别加入2.5μlA、C、G、T测序酶终止混合液至A、C、G、T管的底部

4. 在临用前,才用测序酶稀释液稀释测序酶/焦磷酸酶混合物至1~2U测序酶/μl,置于冰浴。 

5. 将下列试剂加入已退火的引物和模板中(1)2μl 标记混合物(2)0.5~1.5μl 10mCi/ml[α-32P]dATP(3)2μl 稀释的测序酶/焦磷酸酶混合液(4)总体积在14.5~16μl,于25℃(室温)温育5min。 

6. 加入3.5μl标记反应物至含测序酶终止混合物A的微量离心管中。

7. 用吸管上下抽吸轻轻混匀,对 A、C、G、T 管重复此过程,每次均需更换吸头,于37℃温育5~10min。 

8. 加入4μl终止/加样染料液,于95℃水浴2min,然后置于冰浴。

9. 每样品各取2~3μl加样于测序胶进行凝胶电泳并读出序列。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

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