通过CsCl等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒实验

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【摘要】CsCl等密度梯度离心用于制备最高纯度的感染性λ噬菌体颗粒,它没有任何细菌核酸的污染。从这种噬菌体颗粒中提取的DNA可用作DNA测序的模板、亚克隆至质粒载体和产生用于原位杂交的探针。这种方法第二个优点是,由它所获得的噬菌体原种是高度浓缩的(大于1011cfu/ml),在4℃保存时,许多年后仍能保持它们的感染力。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

【内容】通过CsCl等密度梯度离心纯化λ噬菌体颗粒实验

 

实验方法原理

  CsCl等密度梯度离心用于制备最高纯度的感染性λ噬菌体颗粒,它没有任何细菌核酸的污染。从这种噬菌体颗粒中提取的DNA可用作DNA测序的模板、亚克隆至质粒载体和产生用于原位杂交的探针。这种方法第二个优点是,由它所获得的噬菌体原种是高度浓缩的(大于1011cfu/ml),在4℃保存时,许多年后仍能保持它们的感染力。

 

实验材料

λ噬菌体悬浮液

 

试剂、试剂盒

CsCl乙醇

 

仪器、耗材

BeckmanSW41或SW28转子或相当型号BeckmanTi50或SW50.1转子或相当型号皮下注射用针头

 

实验步骤


一、材料

1.缓冲液和溶液(1)CsCl(固体)(2)CsCl溶液(3)乙醇;

2.离心机和转子(1)BeckmanSW41或SW28转子或相当型号(2)BeckmanTi50或SW50.1转子或相当型号,配有清亮的离心管(如Beckman超亮离心管);

3.专用设备皮下注射用针头(21号);

4.载体和菌株λ噬菌体悬浮液。
 

二、方法
 

1.测定噬菌体悬浮液的体积,每毫升加入0.5g固体CsCl,搅拌混匀使其完全溶解。

2.倒入足够量的CsCl分级梯度,使噬菌体悬浮液分成几个组分,每个梯度能容纳约16ml噬菌体悬浮液。所需分级梯度的量等于亲水相的最终体积(步骤1),亲水相又被分成数份,每份为0.4X离心管体积。用适合于BeckmanSW41或SW28转子(或相当型号)的清亮塑料离心管(如Beckman超亮离心管)。

3.在ρ=1.50g/ml和ρ=1.45g/ml两层界面的相应试管壁外侧,用永久性标签笔作上标记。CsCl分级梯度大约占超离管体积的60%。比如,对一个能装38ml的BeckmanSW28试管(或相当型号),分级梯度由三种均为7.6ml的CsCl溶液组成。平衡管装有同样密度的CsCl溶液。

4.小心地将噬菌体悬浮液加至分级梯度上,4℃,87000g(22000r/min于BeckmanSW28转子中)离心2h。

5.按下面的方法对离心管进行穿孔,以收集噬菌体颗粒。(1)用酒精仔细地擦去离心管外的油污,然后在离心管的外侧贴上Scotch胶带,与噬菌体颗粒带平齐。胶带起到封条的作用,防止针头四周渗漏。(2)用21号皮下注射用针头(不需要注射针筒)穿过胶带刺入离心管,收集噬菌体颗粒带。手指远离针头刺入方向,以免剌穿离心管。注意不要使梯度中其他带内物质污染噬菌体颗粒。这些带内含有细胞碎片和未装配的噬菌体成分。

6.将噬菌体颗粒悬浮液装入适宜于BeckmanTi50或SW50.1转子(或相当型号)的超离管中,加入CsCl溶液(ρ=1.5g/ml于SM中)。4℃,150000g(41000r/min于BeckmanTi50转子中)离心24h或160000g(36000r/min于BeckmanSW50.1转子中)离心24h。

7.如步骤5所述收集噬菌体颗粒带,于CsCl溶液中4℃密封保存于一试管中。

8.(可供选择)如果必要,噬菌体颗粒可通过新一轮的CsCl平衡梯度离心进一步纯化和浓缩。将噬菌体悬浮液转移至适宜于BeckmanSW50.1转子(或相当型号)的一个或多个超离管中,加入CsCl溶液(ρ=1.5g/ml于SM中),160000g(36000r/min于BecrkmanSW50.1转子中)4℃离心24h。当离心完成后,如下面“替代方案”的步骤3和4所述收集噬菌体颗粒。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金