关键词:DNA 接头分区 诱变 merck abcam 生工生物 天根生化 全式金

 

【摘要】Linkerscannermutations(接头分区突变):体外在限制性片段加上位点,使两个DNA分子发生重组产生,结果在重组的位点加上连接序列。

【内容】嵌套缺失和互补寡核苷酸进行接头分区诱变

 

实验材料

DNA

 

试剂、试剂盒

雾水乙醇EDTAT4DNA连接酶TENaCl

 

仪器、耗材

培养箱水浴锅

 

实验步骤

1. 用Bal31或外切核酸酶Ⅲ及S1核酸酶在质粒的目的区域产生一嵌套式的5’或3端'缺失突变体。首先在目的序列附近用一限制酶使质粒线性化,在用Bal31消化时,应确定其切割效率,以便弄清毎切割6~8个目的碱基对和覆盖待诱变区所需的时间。 

2. 将合成接头与经适当时间酶切处理的DNA连接。用适当的限制酶进行切割以产生在缺失末端上带有接头而在另一端上含有载体位点的片段。

3. 用低熔点琼脂糖凝胶分离目的片段,将该片段与载体片段相连,以产生带缺失突变的完整质粒。

4. 用连接混合物转化合适的大肠杆菌,挑克隆,小量制备质粒DNA。

5. 用限制性内切酶消化小量制备的质粒DNA,以产生一端含缺失终点的小DNA片段,进行非变性聚丙烯酰胺或筛分型琼脂糖凝胶电泳来确定DNA片段的大小,以此说明缺失突变末端的存在。选择适当的限制性酶以便获得200~300bp小片段。

6. 对目的区域内成套的缺失突变体测序,以确定准确的缺失终点。

7. 设计互补寡核苷醆,以恢复位于每一缺失末端的接头与5’系列缺失体的上游限制性酶切位点之间或者位于接头与3’系列缺失体的下游切点间的野生型序列。 

8. 制备下列片段以便与寡核苷酸相连:

(1)从每个缺失突变体上切下的一段穿过接头位点和在质粒的药物抗性标志(促变片段)内很方便的位点的片段。

(2)从野生型质粒切下来的穿过药物抗性位点和被诱变区域附近的限制性位点的骨架片段,分离这些片段。 

9. 将每种寡核苷酸以大约100μg/ml的浓度重悬于含15mmol/lNaCl的TE缓冲液内,各种片段以等摩尔数混合,65℃保温10min。

10. 慢慢冷却至室温20min,测A260以确定浓度,取小量样品在4%的筛分型琼脂糖凝胶进行电泳监测杂交情况。 

11. 将三种成分按如下方法连接起来:促变片段和骨架片段等摩尔数混合,加摩尔数相对质粒片段50倍过量的杂交寡核苷酸,在10μl总体积内,DNA总量约为400μl。加0.4μlT4DNA连接酶,15℃保温2h。如在促变片段和骨架片段间通过平末端连接,应加1μl连接酶并在30℃保温2h。用TE缓冲液稀释40倍至1μg/ml。

12. 连接反应液在65℃灭活10min,慢慢冷却至室温。 

13. 用20~25μl稀释的连接反应液转化合适的大肠杆菌,涂布在选择培养基上,5%的连接液可产生20~30个克隆,而且所有的克隆均有正确的结构。

14. 挑克隆,小量制备质粒DNA,通过限制性酶切消化和DNA测序验证DNA。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

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