关键词:化学发光 双脱氧 DNA测序 merck abcam 生工生物 天根生化 全式金

 

【摘要】标准的双脱氧DNA测序可以很容易和很有效地使用非同位索标记的化学发光法进行检测。在测序反应中,使用生物素标记的引物。用非同位素标记如生物素衍生化的引物,可用于为5’-末端标记引物而设的入测序反应的工作方案。

【内容】利用生物素标记引物

实验材料

DNA

 

试剂、试剂盒

生物素Tris·ClMgCl2DNA聚合酶dATPdCTPdGTPdTTP

 

仪器、耗材
 

热循环仪尼龙膜滤纸离心机

 

实验步骤

1. 在微量离心管中混匀下列试剂,配制DNA摸板混合物

(1)1μg单链DNA模板或1~3μg变性双链DNA模板

(2)0.5pmol生物素酰化DNA测序引物

(3)2μl5×Bst反应缓冲液

(4)加水至11μl

(5)加热至70℃,然后在30min以上的时间內,慢慢冷却至30℃。

2. 当模板混合物冷却的同时,各取2μl小份的A、C、T、G引物终止混合液,加于4个独立的微量离心管或微量滴定板的孔中,然后做好A、C、G、T的标志。

3. 在65℃预热盛有终止混合物的管子或滴定板。

4. 加入1μlBstDNA聚合酶于步骤1冷却后的模板混合物中。 

5. 步骤2准备好的每个引物终止混合物中,各加入2.5μl聚合酶/模板混合液,于65℃温育5min。 

6. 用水将20×追加溶液贮液稀释成1×追加溶液,往每个样品管或孔中各加入2μl1×追加溶液,于65℃温育5min。

7. 各管或孔中加入4μl终止溶液。 

8. 准备好标准的0.2~0.4mm厚含8mol/l尿素的测序胶。

9. 加样前,样品于80℃温育2min,置于冰浴,加样2~3μl,电泳,监测示踪染料的迁移。 

10. 剪三张与凝胶大小刚好或稍大的Whatman3MM滤纸,剪下一片能盖过凝胶需转移区域的尼龙膜。 

11. 拆卸凝胶装置,分开玻璃平板。

12. 将一张Whatman3MM干滤纸放于凝胶上,然后通过剥起滤纸小心将凝胶揭起。

13. 将贴着凝胶的滤纸,胶面朝上放在玻璃平板上。

14. 将尼龙膜浸没TBE缓冲液中,或用喷水瓶喷射TBE缓冲液使之完全润湿。

15. 小心将湿润的膜放在凝胶上,用吸管或平滑的玻璃棒在膜上滚动以排去气泡。

16. 在膜的上面放两张Whatman3MM 干滤纸,滤纸上放另一块玻璃平板并在其上加以2~4kg重物,转移1h。

17. 分离测序胶/膜夹层,小心从凝胶上剥下膜,并用铅笔在膜与凝胶接触的一面作好标志,将膜放在滤纸上,晾干约10min。

18. 使用紫外线交联装置,紫外透照仪或手恃式紫外灯,照射转印膜以固定DNA,总紫外线照量为120MJ/cm2。

19. 接着进行步骤20的操作或将膜放在两层保鲜膜之间,在4℃可保存6个月。 

20. 将膜放入可加热封闭的大袋子中,加入500ml封阻液Ⅰ,小心排去气泡,密封口袋,放置10min。

21. 按下述过裎处理膜

(1)200ml 偶联物缓冲液20min

(2)500ml 封阻液15min

(3)500ml 洗涤缓冲液Ⅰ10min,3次

(4)500ml 分析缓冲液2min

(5)50ml二氧杂环丁烷检测5min21. 从袋子中排出过量的检测液,平整所有的皱折,重新密封口袋。

22. 室温将包着的膜直接与X光感光片接触使之曝光。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)

merck

abcam

生工生物

天根生化

全式金