辐射诱导型SOD2过表达慢病毒在结肠癌放疗中的靶向性辐射防护和肿瘤增敏效应

关键词:辐射诱导型SOD2 过表达 慢病毒 结肠癌 放疗 靶向性辐射防护 肿瘤增敏效应 雷磁 求精 广州洁特 jet 盐城华鸥 蜀牛

 

2.2.4CCK-8法检测细胞增殖

(1)T25cm2细胞培养瓶中细胞处于对数生长期时,1´PBS溶液清洗1次,加入0.25%胰酶1ml消化细胞1-2min后,加入5ml完全培养基终止消化,轻轻吹打为细胞悬液(2)转移到10mleppendorf管中,1000rpm(100´g)离心3-5min,弃上清,加入5ml完全培养基,重悬细胞沉淀(3)倒置相差显微镜下进行细胞计数,倍比稀释细胞悬液,调整细胞浓度为1´104/ml(4)用多通道移液器吸取200μl细胞悬液,加入到对应的96孔板中(2000个细胞/孔),每板接种5孔,注意设置一个对照孔(只加培养基);96孔板同一批次接种8块,放入细胞培养箱中常规培养,每隔2-3d换液1次(5)第2天选择某一固定时间点,从培养箱中取出随机取出一块96孔培养板,多通道移液器每孔内加入10μlCCK-8溶液(6)放入培养箱孵育0.5-4h,注意动态观察培养基颜色变化(7)用酶标仪在450nm测定吸光度,计算5孔的平均值(8)此后每隔24h,同一固定时间点随机取出一块96孔板,加入CCK-8溶液后进行吸光度测量。(9)用具有作图功能的软件以时间和吸光度为参数进行绘制生长曲线。

2.2.5平板克隆形成实验

(1)取T25cm2对数生长期的细胞,弃去原有培养基,加入1´PBS5ml清洗

1次,弃去清洗液,加入1ml胰酶消化1-2min(2)加入5ml含10%BSA的DMEM完全培养基终止消化,用吸管轻轻吹打,将细胞吹散为单细胞悬液,转移到10mleppendorf管中,100´g离心3min,小心弃去上清,加入5ml完全培养基重悬细胞(3)细胞计数板于倒置相差显微镜下计数细胞,调整细胞浓度为1´105/ml,倍比稀释至1-10´103/ml

(4)取100μl细胞悬液,加入完全培养基3ml,混匀后转移到60mm细胞培养皿中,轻轻―8‖字混匀后,置于细胞培养箱常规培养2周左右,培养期间观察培养液颜色变化,根据情况换液体(5)观察培养皿,待培养面出现肉眼可见的细胞克隆时,终止培养,弃去原有培养基,加入1´PBS清洗2-3次,弃去清洗液(6)95%乙醇2-3ml固定5-10min,弃固定液(7)加入4g/L的结晶紫溶液染色15-30min(8)轻轻在清水中漂洗培养皿,洗涤未结合的结晶紫,空气中干燥(9)计数肉眼可见的克隆数,克隆形成率=(克隆数/细胞接种数)´100%(10)拍照

2.2.6流式细胞仪检测凋亡

(1)6孔培养板弃去原有培养基,1´PBS清洗1次,加入用不含EDTA的胰酶0.5-1ml消化,时间1-2min(2)加入3ml完全培养基终止消化,转移到10mleppendorf管中200´g离心3-5min,使细胞沉淀于管底(3)轻轻弃去上清液,加入1´PBS3ml重悬细胞,200´g离心3-5min,使细胞沉淀。重复清洗1次,重悬细胞后收集1-5´105细胞(4)在50μl的bindingbuffer中加入5μl7-AAD染液,混匀(5)收集的细胞中加入上述混匀后的7-AAD染液;用锡箔纸包被避光,室温下反应5-15min。(6)再加入450μl的bindingbuffer,混匀(7)加入1μlAnnexinV-PE混匀,注意避光,室温下反应5-15min(8)在1h内上机做流式细胞仪检测

2.2.7流式细胞仪检测细胞周期

(1)取处于对数生长期的6孔板细胞,用1´PBS3ml清洗1次,加入0.25%胰酶0.5-1ml消化1-2min后,加入完全培养基终止消化

(2)轻轻吹打细胞培养面,转移细胞悬液至10mleppendorf管中,预冷的1´PBS3ml离心漂洗3次,1000rpm离心3min,弃上清(3)加入预冷的1´PBS溶液0.75ml,然后加入4%的多聚甲醛0.25ml,使甲醛的终浓度为1%,室温固定1h

(4)离心吸弃上清,用0.3ml含10%小牛血清的PBS重悬,再缓慢加入0.7ml水乙醇,震荡均匀,封口膜封口,4°C或-20°C固定24h以上(5)检测前,1000rpm离心3-5min、1´PBS洗涤,重复2次

(6)配置DNA染色液,各组分如下:

组分名称加入量

Triton–X10010uL

碘化丙碇(1mg/ml)200μl

DNase-freeRNase2mg1´PBS9.79ml

Total10ml

(7)加入DNA染液染色处理15min,上机进行流式细胞仪检测,在488nm波长激发光激发下测定各样本荧光强度,Dean-Jett-Fox拟合细胞周期数据。

2.2.8建立裸鼠移植瘤模型

实验步骤:

细胞准备:在T75cm2扩增培养HT29和稳转SOD2HT-29细胞株,细胞汇合度70%-80%时,PBS缓冲液15ml洗一次培养面,胰酶3ml常温下消化细胞1-2min,使细胞脱壁、分离,用无血清培养液洗涤细胞2次。(2)悬液制备:将消化下来的细胞重悬于无血清的DMEM高糖培养基中,计数细胞,调整细胞密度为1´108/ml,置于冰浴中。(3)细胞注射:BALB/c裸鼠背部靠近下肢前缘处三角区为荷瘤注射位点,局部皮肤用75%的酒精消毒,用7号针头接1ml注射器吸取细胞悬液,加等量的基质胶,颠倒混匀后换用6号针头,皮下注射细胞悬液100μl,含有5´106个细胞。(4)观察荷瘤情况:接种肿瘤细胞后定期对裸鼠进行观察,观察裸鼠生存状态和肿瘤生长情况。(5)待裸鼠荷瘤模型肿瘤生长至100mm3时(肿瘤体积=ab2/2,a:最长径,b:最短径),采用随机分组的方法分为4组,每组6只:①正常组(Normal,未处理组);②SOD2治疗组(SOD2,HT-29移植瘤内、瘤周注射慢病毒pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP11´108TU,1次/d,连续3d);③单纯照射组(Normal+Radiation,每日行肿瘤局部放射,2Gy/次,连续3d);④SOD2+照射组(SOD2+Radiation,HT-29移植瘤内、瘤周注射慢病毒pLVX-C9BC-SOD2-T2A-AcGFP11´108TU,1次/d,连续3d;最后一次注射72h后,每日行肿瘤局部放射,2Gy/次,连续3d)。

2.2.14标本免疫组织化学法染色

(1)切片:蜡块常规切片,厚度3-5μm

(2)脱蜡至水:同H-E染色

(3)消除内源性过氧化物酶活性:3%过氧化氢溶液室温孵育切片5-10min,蒸馏水漂洗2min´3次

(4)抗原修复:微波炉内抗原修复5-10min,修复液为0.01M的枸橼酸钠溶液(pH=6.0)

(5)自然冷却降温后,蒸馏水漂洗,PBS溶液(pH=7.2-7.4)浸泡5min

(6)抗原封闭:5%-10%的山羊血清封闭,室温孵育10min

(7)孵育一抗:弃血清,蒸馏水漂洗,滴加1:500稀释的SOD2抗体,注意抗体需要完全覆盖组织切片,4°C孵育12-16h(8)PBS冲洗,5min´3次

(9)孵育二抗:滴加1:500稀释的生物素标记二抗,37°C湿盒内孵育30min

(10)PBS冲洗,5min´3次

(11)滴加辣根标记链霉卵蛋白素,37°C湿盒内孵育30min(12)PBS冲洗,5min´3次

(13)显色:滴加新鲜配置的DAB显色液,注意液体完全覆盖组织切片,避免边缘效应出现,显色时间在3min左右。

(14)流水漂洗5min´3次

(15)复染细胞核:苏木素染色30sec左右

(16)流水漂洗3-5min

(17)1%盐酸酒精分化,流水漂洗3-5min

(18)梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶常规封片。

2.2.15细胞原位凋亡检测

(1)切片:蜡块常规切片,厚度3-5μm(2)脱蜡至水:同H-E染色(3)蛋白酶K消化:蛋白酶K消化液(15微克每毫升)37°C孵育15分钟,1´PBS漂洗5min´3次(4)通透处理:0.1%Tritonx-100通透10分钟,1´PBS漂洗5min´3次(5)滴加TUNEL反应液(Roche):溶液I5μl和溶液II45μl充分混匀,37°C反应60min;1´PBS漂洗5min´3次(6)滴加溶液III50μl,37°C孵育30min,1´PBS漂洗5min´3次(7)DAB显色:滴加新鲜配置的DAB显色液,注意液体完全覆盖组织切片;1´PBS漂洗5min´3次(8)苏木素复染,常规封片:操作方法同前。

1.2.7H9c2细胞RNA提取

(1)将提取RNA所需试剂和器材提前准备好,备冰,并且将低温高速离心机预冷至4℃。(2)取出细胞,吸净培养瓶中的培养基,注意不要碰触细胞,用预冷的PBS清洗细胞3次后,吸尽残余PBS,加入0.5mlRL裂解液(每6孔板中的一个孔),使裂解液与细胞充分接触,大约需要1-2min。(3)用枪头吹打细胞使其完全脱落,全部混在裂解液中,将所得溶液转移到去酶EP管中,再加入100μl氯仿,剧烈震荡30s,室温孵育3分钟。(4)12,000rpm,4℃,离心10min。(5)小心吸取最上边的透明水相300μl到另一个洁净的置于冰上预冷去酶EP管中。(6)向EP管中加入300μl70%乙醇,颠倒混管内液体。(7)将步骤(6)中的600μl液体转移入预冷的吸附柱RA中(内套有收集管)

,10,000rpm,离心1min,弃去废液。(8)将吸附柱放回收集管中,置冰上,加入500μl去蛋白液RE,12,000rpm,4℃,离心1min,弃废液。(9)向吸附柱中RA加入700μl漂洗液RW,12,000rpm,4℃,离心1min,弃去废液。(10)向吸附柱中RA加入500μl漂洗液RW,12,000rpm,4℃,离心1min,弃去废液。(11)吸附柱重新放回收集管,12,000rpm,4℃,离心2-3min。(12)把吸附柱放入一新的去酶EP管中,在膜的中间部位加入50μl去RNA酶的ddH2O,室温放置2min后,12,000rpm,4℃,离心1min,EP管中即为所获得的RNA溶液。(13)检测RNA浓度及纯度。

1.2.11细胞核蛋白提取

(1)将提取蛋白所需试剂和器材提前准备好,备冰,并且将低温高速冷冻离心机预冷至4℃。(2)配制胞浆蛋白裂解液:每100μlBufferA中加入DTT0.1μl、PMSF0.5μl及蛋白酶抑制剂0.5μl;配制核蛋白细胞裂解液:每100μlBufferC中加入DTT0.1μl、PMSF0.5μl及蛋白酶抑制剂0.5μl。(3)准备各处理组细胞,倒掉培养基,用预冷的PBS清洗细胞3次后,吸尽残余PBS。(4)向每瓶细胞培养瓶中加入新的预冷的PBS1-2ml,用细胞刮将培养瓶细胞面的细胞全部刮下,使其全部悬浮于PBS溶液中。将细胞液转移到预冷的EP管中。(5)5,000rpm,4℃,离心5min,弃上清。(6)用新预冷的PBS溶液重悬细胞团,5,000rpm,4℃,离心5min,弃上清。(7)重复第(3)步,共洗涤细胞2-3次。(8)5,000rpm,4℃,离心5min,弃上清。(9)向细胞沉淀中加入适量BufferA混合液(一般每20μl细胞压积加入BufferA200μl),剧烈震荡15s后放于冰上孵育大约15min。(10)再加入BufferB(每100μlBufferA中大约需要5.5μlBufferB),剧烈震荡15s,放置冰上1min。(11)剧烈震荡15s后,4℃,12000rpm,离心5min。(12)迅速将上清转入另一洁净EP管,即为所得胞浆蛋白。(13)再向细胞沉淀中加BufferC(一般每20μl细胞压积大约需要加入BufferC100μl),漩涡振荡器上剧烈震荡15s,放在冰上孵育大约40min,每隔10min就要剧烈震荡1次。(14)12,000rpm,4℃,离心10min,上清液即为提取到的核蛋白。

1.2.12细胞全蛋白提取

(1)相关物品准备基本同核蛋白提取。(2)配置全蛋白裂解液:每1mL冷LysisBuffer中加入5μL磷酸酶抑制剂,1μL蛋白酶抑制剂和5μL100mMPMSF,混后置冰上,待用。(3)用预冷PBS将细胞清洗3次,尽量将残余液体吸净,加入新的PBS2ml,用细胞刮将瓶底细胞全部刮下,使其悬在PBS溶液中。(4)4000rpm,4℃,离心5min。(5)弃上清液,加入1mlPBS重悬细胞;重复步骤(4)。(6)得到的细胞沉淀中加入之前配好的全蛋白细胞裂解液,据经验,每个T75培养瓶中的细胞需要100μL蛋白裂解液。(7)置于4℃摇床上振荡15min。(8)12000rpm,4℃,离心15min,上清液即为提取到的全蛋白,测定浓度后,分装后于-70℃保存。

1.2.15染色质免疫共沉淀(ChIP)(一)细胞细胞交联与溶解(1)细胞计数:每做一次需要1-2×107个细胞(根据经验,每T75培养瓶可生长H9C2细胞大约1×107个细胞);(2)接冰,预冷PBS;(3)SDS裂解液使用之前放至室温,使用之前确保其已经完全溶解;(4)蛋白酶抑制剂Ⅱ放至室温解冻;(5)准备37%甲醛(Sigma,甲醛质量好坏对于细胞交联及后续试验非常关键);(6)细胞用预冷的PBS清洗2-3遍,洗净多余的PBS,加入10mlDMEM培养基,再加入275μl37%甲醛,室温静置10min;(7)准备离心管,每管加,PBS2ml+10μl蛋白酶抑制剂Ⅱ,置于冰上;(8)接着6做,向每个培养瓶中加1ml10×甘氨酸,中和甲醛的作用,轻轻混,室温静置5min;(9)培养瓶置于冰上,洗净液体,不要触及细胞;(10)用PBS冲洗细胞2遍,将步骤(7)中配置的液体加入培养瓶中,用细胞刮将细胞全部刮下溶于PBS溶液中;(11)将液体转移至EP管中,3000rpm,4℃,5min离心;(12)配裂解液:每1mlSDS裂解液中加入5μl蛋白酶抑制剂Ⅱ(每1×107个细胞需要1ml裂解液),(13)接着(11)做,弃上清,加(12)步配好的液体加入细胞团,重悬细胞,轻轻吹大,避免大量气泡产生,影响超声效果。(二)超声破碎DNA(1)超声切割:取新的EP管,加入第(一)步处理好的细胞裂解液,每管大约300-500μl,利用超声破碎仪对细胞DNA进行切割,超声条件为:功率450W,间歇时间30s,工作时间30s,连续45次;(2)DNA琼脂糖凝胶电泳:取5μl超声切割后的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,按照DNA:上样缓冲液=5:1体积,加入6×DNA上样缓冲液,观察DNA切割情况,如DNA片段集中于200-1000bp之间,则说明切割成功,如大部分片段大于1000bp则再重复步骤1)和2);(3)经琼脂糖凝胶电泳验证DNA切割成功后将细胞悬液于12,000rpm,4℃,离心10min,取上清,分装,每管100μl,于-70℃保存,丢弃沉淀。(三)免疫沉淀交联的DNA-蛋白复合物:(1)配蛋白酶抑制Ⅱ稀释液:每900μl的ChIPDilutionbuffer中含蛋白酶抑制剂4.5μl蛋白酶抑制剂Ⅱ;(2)取出超声切割后的样品100μl,加入900μl的蛋白酶抑制剂Ⅱ稀释液;(3)加入60μl的蛋白G琼脂糖,轻柔得颠倒混,放于4℃旋转摇床上,注意低速,1小时。(4)对(3)中液体,3000rpm,室温,1min离心;(5)吸10ul上清作为input组,保存于4℃;(6)收集上清,吸取1ml至新的EP管中,沉淀丢弃;(7)向新的EP管中加入acH3抗体(5μl),阳性对照组中加anti-RNApolymernse(1.0μg),阴性对照组加入:NormalMouseIgG(1.0μg);(8)4℃旋转摇床上过夜,大约14-16小时;(9)每管加60μl蛋白G琼脂糖,4℃,旋转1h;(10)3000rpm,常温,离心1min,弃上清;(11)洗涤蛋白G琼脂糖-抗体/免疫沉淀复合物,按下列顺序及方法依次洗涤:加入洗涤液1ml后,摇床上清洗5min,3000rpm离心1min,去除清洗液,再进行下一轮清洗;(四)洗脱蛋白/DNA相互作用:(1)将1MNaHCO3置于室温,将水浴箱调至65℃。(2)配ElutionBuffer:每管需要无菌ddH2O170μl,20%SDS10μl,1MNaHCO320μl,可根据管数适当扩大体系。(3)向input管中加入配好的ElutionBuffer200μl,室温放置。(4)向装有抗体/蛋白G琼脂糖的管中加入100μlElutionBuffer,轻弹使之混,室温下孵育15min;(5)3000rpm,1min,收集上清液至新的EP管中;(6)重复(4)(5),再收集100μl,一共收集200μl;(五)DNA-蛋白复合物的逆交联:(1)向所有EP管中(包括DNA-蛋白复合物中及input组)加入8μl5MNaCl,65℃水浴,4-5小时;(2)向所有EP管中加入1μlRNAaseA37℃,水浴30min;(3)向所有EP管中加入4μl0.5MEDTA,8μl1MTris-HCl,1μl蛋白酶K,45℃,孵育1-2小时;(六)DNA纯化:(1)标记放有旋转柱的收集管及空收集管;(2)第(五)步的DNA样品中加入1ml粘合剂“A”(BindregantA)混;(3)上述混合液先转移600μl至旋转柱,12000rpm,离心30秒,常温,其收集管废液,再将剩余的600μl混合液转移至旋转柱,离心弃废液;(4)加500μl洗涤剂B,常温下12000rpm,离心30秒,弃收集管中废液,将吸附柱重新套回收集管中,12000rpm,离心30秒;(5)将吸附柱重新放入一个新标记好的空收集管中,在吸附柱中间膜部加入50μlElutionBufferC,室温静置2min;(6)12,000rpm,离心30s,EP管中的液体即为提纯得到的DNA。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)