关键词:Per2     科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOT

 

1.2实验方法1.2.1总RNA的提取

(1)紫外照射净化工作台,4℃预冷PBS;

(2)取出T25培养瓶,观察细胞生长融合至90%以上的。于净化工作台内移液器吸去旧培养液,加入2mlPBS,轻轻倾斜培养瓶,让PBS流过所有细胞后静置30s,吸净PBS;

(3)PBS重复洗涤细胞两次,T25倒置于滤纸上吸干;

(4)每瓶T25培养瓶中加入1ml的TAKARA9109,盖上瓶盖,让液体覆盖所有细胞,冰上静置5min;

(5)移液器反复轻轻吹打约70次,确保绝大部分细胞已完全降解,将液体转移到1.5ml无酶EP管中,尽量少产生气泡;

(6)加入氯仿0.2ml(体积量为TAKARA9109的1/5),旋紧离心管盖,用手剧烈地振荡30S。待溶液充分乳化(此时无分相现象)后,再于室温静置4min,可见液体自动分为两层,上层为水相,下层为酚相;

(7)12000rpm,4℃,离心15min;

(8)从离心机中小心地取出离心管,可见液体分为三层:无色的上清液、白色的中间蛋白层及带有颜色的下层有机相。用200μl的移液枪分次吸取上清液转移至另一新的离心管中。总量约400-500μl,不要贪多,切勿吸到中间的蛋白层;

(9)向上清液中加入与上清液等体积量的异丙醇,上下颠倒离心管以充分混匀,然后,在室温下静置10min;

(10)12000rpm,4℃,离心10min,轻轻倒掉上清液;

(11)轻轻沿离心管壁加入75%的乙醇lml(750μl无水乙醇+250μlDEPC水,现用现配,冰上放置待用),小心勿触及沉淀,轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁;

(12)12000rpm,4℃,离心5min后倒掉乙醇。12000rpm,4℃,离心2min后用移液枪尽量吸净乙醇,注意不要碰到沉淀;

(13)室温干燥沉淀2-5min,待沉淀为半透明,加入20μl的DEPC水溶解沉淀,观察沉淀是否完全溶解;

(14)用可见紫外分光光度计测定提取RNA的OD值和浓度。RNA保存于-80℃。

1.2.2逆转录:

按照TAKARA047A操作手册进行

1.去除基因组DNA:于冰上将以下组份混匀:

试剂使用量

5×gDNAEraserBuffer2.0μl

gDNAEraser1.0μl

TotalRNA1.0μg

RNaseFreedH2O加满至10μl

混合均匀以后,室温放置25min。

2.逆转录反应:于冰上将以下组份混合:

试剂使用量终浓度

步骤1反应混合液10μl

PrimeScript®RTEnzymeMixI1μl

RTPrimerMix1μl

5×PrimeScript®Buffer2(forRealTime)4μl1×

RNaseFreedH2Oupto20μl

总量为20μl,反应条件:42℃15min,85℃5s,4℃5min。CDNA保存于-20℃。

1.2.4贴壁细胞蛋白的提取

(1)冰上预冷PBS;取T25培养的细胞(生长融合至90%以上),吸去旧培养液,加入PBS2ml,轻轻倾斜培养瓶,让PBS流过所有细胞,后用移液器吸去PBS;

(2)PBS重复洗涤三次后用移液器吸净PBS,倒置于滤纸上吸干;

(3)加入RIPA+PMSF,按照每个T25培养瓶300μlRIPA+3μlPMSF,一个六孔板100μlRIPA+1μlPMSF的比例,确保裂解液可覆盖所有细胞。冰上静置5min;

(4)用细胞刮将细胞面都刮一遍,收集裂解液于EP管中,动作要轻柔,切勿吹打,否则容易产生气泡。于冰上摇床裂解30min。保存于-80℃。

1.2.5BCA法测定蛋白浓度

(1)按照说明书取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mgBSA)中,充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。-20℃保存;

(2)取适量25mg/ml蛋白标准,PBS稀释至浓度为0.5mg/ml,-20℃保存;

(3)样品数量+2,每个样品两个重复。按照50体积BCA试剂A+1体积BCA试剂B的比例计算配制总的BCA工作液,充分混匀;

(4)将标准品(0.5mg/ml)按照0,1,2,4,8,12,16,20μl依次加入到96孔板中,加PBS补足到20μl,;

(5)加入适当体积样品到96孔板的样品孔中,加PBS补足到20μl,每个样品两个重复;

(6)各孔加入200μlBCA工作液,常温摇床充分混匀5min,避免气泡产生;

(7)37℃反应25min;(8)测定A562,根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度,只有R2>0.99时,结果有效;

(9)根据样品的蛋白浓度,加裂解液调整浓度至2μg/μl;

(10)加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液;

(11)将EP管封口后沸水煮10min,-20℃保存;若未煮,则-80℃保存。

1.2.6Westernblot

1.电泳:

(1)清洗玻板:

用纱布在纯水下轻轻擦洗玻板,两面都擦洗过后用大量纯水冲洗干净,立在框里晾干;

(2)配胶比例:

SDS-PAGE分离胶浓度最佳分离范围

6%50-150KD

8%30-90KD

10%20-80KD

12%12-60KD

15%10-40KD

(3)灌胶和上样:

1)将玻板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上准备灌胶。可以先加入1ml蒸馏水,静置1min,观察是否漏胶;

2)配制适当浓度的分离胶,用1ml枪吸取胶沿玻璃板放出,待胶面抵达绿带下缘即可,在胶上方加上无水乙醇以赶走气泡。灌胶时胶一定要沿着玻板一侧边缘流下,加无水乙醇时要慢,否则胶会被冲变形;

3)当无水乙醇与分离胶之间出现一条折射线时,说明胶已经凝固,在等3min,使胶充分凝固,倒去无水乙醇,用滤纸吸干边缘;

4)配制适当浓度的浓缩胶,用1ml枪吸取胶沿玻璃板放出,将剩余玻板空间灌满浓缩胶,轻轻插入梳子,梳子大小一定要匹配,插梳子时要保持梳子水平,梳子插入要完全到位,以保证上样量;

5)待浓缩胶凝固以后(约20min),将玻板待梳子小心取下,固定在架上,放入电泳槽中,注意,红色对红色;

6)电泳槽中加入电泳液,内槽电泳液要加满至溢出,外槽电泳液要没过电极,小心呈垂直方向取出梳子;

7)用微量上样针上样。左右两侧的孔分别加入20μl5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,以防止边缘效。上样孔每孔40μg蛋白,marker约4μl。加入下一个样品时,上样针头需要在外侧电泳槽洗涤3次。

(4)电泳:

接通电源,70V恒压,待marker的红色条带出来后,换成120V恒压继续电泳至溴酚蓝将要跑出电泳槽即可停止。

2.转膜(半干转)

(1)取出电泳槽,轻轻撬开玻板,按照marker的提示切取需要的凝胶部分,放在电转液中浸泡20-60min;

(2)按照目的凝胶的长宽+1mm剪取相应的PVDF膜,用甲醛浸泡2-3min,至PVDF膜变色,后放入电转液中浸泡备用;

(3)按照目的凝胶的长宽剪取增厚滤纸,用电转液浸透;

(4)按照阳极-滤纸-PVDF膜-胶-滤纸-阴极的顺序依次放置,注意两块滤纸不能直接接触以防止短路;

(5)按照目的蛋白小于70Kb时,电转条件为15V,8min;目的蛋白大于70Kb时,电转条件为25V,30min来转膜;

(6)用奶粉液封闭1h,常温,摇床。

电转(湿转):

(1)按照目的凝胶的长宽+1mm剪取相应的PVDF膜,用甲醛浸泡15s,至PVDF膜变色,后放入电转液中浸泡备用。

(2)根据目的凝胶的长宽+0.5mm裁剪滤纸,电转液中浸泡备用。

(3)将夹子打开,使黑色的一面保持水平,其上垫海绵垫一张,按照以下顺序放置:海绵垫—三层滤纸—目的凝胶—PVDF膜—三层滤纸—海绵垫。每层操作的时候用1ml移液枪枪头赶走气泡。

(4)合上夹子卡紧,放入电转槽中,使夹子与电转槽的黑面对黑面。电转槽放入冰盒中,接通电源,设定250mA恒定电流转膜,一般来说1kD蛋白需转1min。

(5)转膜完毕,取出PVDF膜,于电转液中漂洗1min后立即放入有5%脱脂奶粉的平皿中,摇床封闭1h。

3免疫反应

(1)将PVDF膜用滤纸吸干,正面朝上,滴加一抗至全部淹没PVDF膜,赶走气泡,4℃孵育过夜;

(2)PBST摇床洗3次,10min/次;

(3)吸干,用与(1)相同的方法孵育二抗,37℃,1h。

4.化学发光,显影:

(1)PBST摇床洗3次,10min/次。同时避光按照1:1的比例配制显影液;

(2)在暗室中,吸干膜,滴加显影液至膜的正面,2min后,即可上机显影。

1.1.6摇菌扩增质粒:

(1)紫外线照射超净工作台20min;

(2)酒精擦拭超净工作台台面,将离心管,灭菌枪头等放入超净工作台,紫外照射20min;

(3)将1-2μl含Per2干扰质粒的大肠杆菌菌液加入到50ml离心管中,再加入3-5mlLB液;

(4)27℃,>200rpm恒温摇床过夜,见菌液适当浑浊即可。

(5)收获的菌液分装至1ml无菌EP管内,4℃保存。若要长期保存则加入10%体积比例的甘油,摇匀后放置于-80℃。

1.2.7质粒提取:

(1)RNaseA全部加到溶液I(悬浮液)中,充分混匀,4℃保存;

(2)溶液IV(洗涤液)中加入27ml无水乙醇,混匀,4℃保存;

(3)所有操作常温进行,取含质粒的菌液1.5ml,5000g,1min离心,直接倒弃上清液;

(4)重复操作(3);

(5)12000rpm,1min,用黄枪头小心吸去上清液,注意避免碰到沉淀;

(6)每管加入250μl溶液I(悬浮液),轻轻吹打重悬细菌沉淀,至沉淀完全散开,无可见细菌团块;

(7)每管加入250μl溶液II(裂解液),轻轻颠倒离心管4-6次,使细菌完全裂解,至溶液透明。切勿涡旋,涡旋或其他剧烈操作会导致基因组DNA断裂,易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。总裂解时间不超过5min;

(8)每管加入350μl溶液III(结合液),颠倒离心管4-6次,充分混匀,至可见白色絮状物。切勿涡旋,颠倒次数也不宜过多;

(9)1200rpm,10min。离心后会产生白色沉淀;

(10)用移液枪将上清液转移入质粒纯化柱,1200rpm,30-60s,倒掉收集管内的液体;

(11)在质粒纯化柱内加750μl溶液IV(洗涤液),12000rpm,30-60s,倒掉收集管内的液体;

(12)12000rpm,2min,倒掉收集管内的液体;

(13)将质粒纯化柱打开盖子置于1.5ml无菌EP管上,晾5min,使痕量乙醇完成挥发;

(14)直接加入50μl溶液V(洗脱液)至管内柱面中央,使液体被纯化柱吸收,放置1min。如果不慎将溶液V沾在管壁上,一定要轻轻震动离心管,使液体滑落到管底,以便被纯化柱完全吸收;

(15)12000rpm,1min,所得液体即为高纯度质粒;

(16)将质粒转移到1.5mlEP管内,-20℃保存。

1.2.7细胞培养:

1.细胞复苏:

(1)将从液氮罐中取出的冻存细胞快速(尽量1min内)放入提前预热的37℃水浴槽中,快速摇动至冰完全融化。用75%酒精擦拭冻存管后将其放入预紫外照射的生物安全柜中。

(2)离心管中加入9ml含10%胎牛血清的相应培养基,用3ml巴士吸管将冻存管中的液体转移入其中,轻轻吹打混匀。

(3)800rpm,5min离心。弃上清,沿管壁加入相应培养基(含10%胎牛血清),轻轻吹打(70次左右)成单细胞悬液。接种于T25培养瓶中,尽量减少产生泡沫。

(4)75%酒精消毒以后,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。

2.细胞传代:

(1)紫外预照射生物安全柜,从细胞培养箱中取出T25培养瓶,显微镜下观察,当细胞融合至80%时即可传代。

(2)于生物安全柜中倒掉培养基,用PBS荡洗两遍,荡洗时轻柔前后倾斜培养瓶,让PBS流动到瓶底每个位置;

(3)加入1ml0.25%胰酶,让胰酶淹没所有细胞,常温下静置2min(若为口腔黏膜上皮细胞,则需37℃培养箱内消化2-3min),当显微镜下见细胞由贴壁时的伸展状态变为圆形时,轻轻拍打培养瓶(瓶口朝上,避免污染),可见90%以上细胞脱落下来。立即加入含血清的相应培养基终止消化。轻轻吹打70遍,将液体转移入离心管。800rpm,5min。弃上清液,再加入相应的含血清培养基,轻轻吹打成均匀的单细胞悬液后接种于T25培养瓶中。

(4)75%酒精消毒以后,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。

3.细胞换液:

(1)紫外预照射生物安全柜。将T25培养瓶从细胞培养箱中取出,倒置显微镜下观察细胞形态,生长状态,排除污染。

(2)于生物安全柜中倒掉培养基,用PBS荡洗两遍,荡洗时轻柔前后倾斜培养瓶,让PBS流动到瓶底每个位置;

(3)加入相应培养基;

(4)75%酒精消毒以后,置于37℃,95%湿度,5%CO2培养箱。

4.细胞冻存:

(1)紫外线预照射的生物安全柜。倒置显微镜下观察细胞融合至80-90%。倒掉培养瓶中的旧培养液,用PBS溶液轻轻荡洗细胞2-3次后倒净PBS。

(2)胰酶消化。加入0.25%胰酶(刚刚能覆盖住瓶底),于显微镜下观察培养瓶中细胞的变化。当显微镜下见细胞由贴壁时的伸展状态变为圆形时,迅速加入1ml含血清培养基停止消化。

(3)轻轻吹打70遍,将液体转移入离心管。800rpm,5min。

(4)弃上清,加入细胞冻存液1ml,轻轻吹打(避免气泡)成单细胞悬液,用巴士吸管转移到冻存管内。

(5)将冻存后的细胞按照:4℃,20min;-20℃,20min;-80℃,∞的顺序梯度降温,保存在-80℃,择期放入液氮罐中。

5质粒转染:

(1)于转染前一天,将Tca8113细胞接种于六孔板,用无抗生素的1640培养基培养,控制接种细胞密度以保证第二天转染时细胞融合度达60%左右;

(2)酒精擦拭并预照射生物安全柜30min;在生物安全柜里面完成以下操作;

(3)配置混合液I(240μlOPI+10μllipo2000混匀),室温静置5min;

(4)配置混合液II(230μlOPI+20μllipo2000混匀),室温静置5min;

(5)将混合液II逐滴加入混合液I,成为混合液III,边加边摇晃,混匀后室温静置20min;

(6)取出细胞,用无抗生物无血清的1640培养基清洗两遍,清洗时只需让培养基流遍细胞即可。再加入1ml无抗生素含血清的1640培养基;

(7)混合液III均匀加入六孔板对应的孔中,轻轻多方向摇晃混匀。后放入培养箱中;

(8)4-6h后从培养箱中取出六孔板,倒置显微镜下观察细胞状态,记录细胞死亡率;

(9)吸去旧的培养基,加入无抗生素,无血清培养基冲洗两遍,注意动作轻柔,只需轻轻倾斜六孔板,使培养基流遍细胞即可;

(10)加入2ml无抗生素含血清的1640培养基;

(11)24h后,可提取RNA;

(12)48h后,可提取蛋白。

                                                  实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)