RIP1/3依赖的程序性坏死促使OVX大鼠骨细胞过度死亡

关键词：RIP1/3    程序性坏死    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT 

1.2.9HE染色观察形态学步骤：（1）脱钙后的骨组织，流水充分冲洗标本，常规脱水、透明、浸蜡，包埋成石蜡块，切成厚度4μm的超薄组织片,贴在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，置于60℃烤箱内烘烤过夜后备用。（2）光镜下选取组织完整的石蜡切片，投入二甲苯溶液中脱蜡，每次20分钟，共二次；（3）将组织切片依次投入100%乙醇、95％、80％、70％、50％乙醇（每步3分钟）,蒸馏水冲洗20分钟；（4）苏木素染色10分钟；（5）流水充分冲洗30分钟；（6）1％盐酸乙醇分化5-7秒；（7）自来水流水冲洗2分钟；（8）0.5％伊红染液染色8分钟；（9）自来水流水冲洗2分钟；（10）70％、80％、95％、100%乙醇梯度脱水，各5分钟；（11）二甲苯透明二次，每次5分钟；（12）用中性树胶封闭组织片。在普通光学显微镜下观察骨组织结构。

1.2.10电镜(TEM)检测

电镜标本脱钙后，用0.01MPBS充分冲洗，用尖刀片将骨组织修剪为1mm3大小的组织块，送检于重庆医科大学电镜室制作电镜标本。主要操作程序：于2％锇酸（PH为7.4）常温下固定4h,经0.01MPBS充分漂洗后，在4℃下50％、70％、80％、90％乙醇梯度脱水（各20分钟），转入90％丙酮20分钟，再转入常温下100％丙酮（20分钟×3次）。然后包埋于环氧树脂包埋剂中，放置在60℃恒温箱中加热48小时，聚合硬化后形成包埋块。应用超微切片机将标本切成50nm超薄切片，放置在涂有formvar-coated的铜网格上晾干。最后用3%用醋酸铀和柠檬酸铅染色，于透射电镜下观察骨细胞超微结构。

1.2.11免疫组化染色

采用Envision免疫组化染色法检测TNF-α、RIP1、RIP3在骨组织中的表达情况。TNF-α（兔多克隆抗体）稀释为1：100，RIP1（小鼠单克隆抗体）稀释为1：200，RIP3（兔多克隆抗体）稀释为1：100，具体实验步骤如下：（1）石蜡切片脱蜡前置于60℃烤箱中烤60分钟；（2）二甲苯中脱蜡（20分钟×2次）；（3）梯度100%乙醇、95％、80％、70％、50％乙醇（各5分钟），双蒸水5分钟水化；（4）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（5）修复组织抗原：在骨组织切片上滴加专用骨组织抗原修复液100μl覆盖组织，放置于37℃恒温箱中孵育30分钟；（6）操作同（4）；（7）应用3％H2O2室温孵育10分钟，抑制内源性过氧化物酶；（8）操作同（4）；（9）滴加山羊血清封闭液100µl，室温孵育10分钟，摔去封闭液；（10）拭干组织周围，在组织上滴入50µl左右的一抗，在4℃冰箱中孵育过夜；（11）次日重复步骤（4）；（12）组织上滴加试剂盒内试剂1PolymerHelper，置入37℃恒温箱中孵育20分钟；（13）重复步骤（4）；（14）组织上滴加试剂盒内试剂2poly-HRPanti-RabbitIgG或poly-HRPanti-MouseIgG，置入37℃恒温箱中孵育20分钟；（15）重复步骤（4）；（16）在显色前5分钟，配置DAB显色液，在组织上滴加50µlDAB显色液，迅速在显微镜下观察，显色约15秒，待阳性结果出现，自来水立即终止显色；（17）苏木素染色10分钟，自来水冲洗30分钟返蓝；（18）1％盐酸酒精5秒，流水冲洗5分钟；（19）依次梯度酒精脱水，二甲苯透明，组织未干燥时，中性树胶封固。（20）在光学显微镜下，TNF-α、RIP1和RIP3以细胞浆中出现棕黄色为阳性。采用LeicaDM6000B全自动数码成像及分析系统检测TNF-α、RIP1和RIP3蛋白表达情况，每个样本随机选6个视野计算阳性细胞百分数，进行统计分析。

1.2.12TUNEL+cleavedcaspase-3荧光染色

此实验用于鉴别TUNEL阳性细胞是坏死还是凋亡[12]。Cleavedcaspase-3（兔单克隆抗体）稀释为1：100，TUNEL原位凋亡荧光检测试剂盒购买于德国Roche公司，具体实验步骤如下：（1）从石蜡组织切片常规脱蜡至水的方法同1.2.11免疫组化染色步骤（1）（6）。（2）应用0.3％TritonX-100室温孵育10分钟；（3）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（4）滴加山羊血清封闭液100µl，室温孵育10分钟，摔去封闭液；（5）拭干组织周围，在组织上滴入50µlcleavedcaspase-3一抗（稀释为1：200），在4℃冰箱中孵育过夜；（6）次日，0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次），以下操作步骤在暗室进行；（7）滴加1：100稀释Dylight594山羊抗兔IgG二抗，在37℃冰箱中孵育60分钟；（8）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（9）滴加TUNEL试剂盒混合液（使用前10分钟，试剂A和B等体积混合），在37℃冰箱中孵育60分钟；（10）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（11）DAPI染核5分钟；（12）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（13）用50%甘油封片，指甲油固定。（14）在Olympus激光共聚焦显微镜下，采集图片，每个样本随机选6个视野计算阳性细胞百分数，进行统计分析。

1.2.13RIP1和RIP3双标免疫荧光染色

石蜡组织切片常规脱蜡至水的方法同1.2.11免疫组化染色步骤（1）（6）。（2）应用0.3％TritonX-100室温孵育10分钟；（3）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（4）滴加山羊血清封闭液100µl，室温孵育10分钟，摔去封闭液；（5）拭干组织周围，在组织上滴加RIP1和RIP3一抗混合液（RIP1小鼠单克隆抗体和RIP3兔多克隆抗体均稀释为1：100，二者混合），在4℃冰箱中孵育过夜；（6）次日，在37℃冰箱中孵育60分钟；（7）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次），以下操作步骤在暗室进行；（8）滴加1：200稀释的Dylight594山羊抗小鼠IgG和Dylight488山羊抗兔IgG混合液，在37℃冰箱中孵育60分钟；（9）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（10）DAPI复染细胞核5分钟；（11）0.01MPBS缓冲液冲洗（5分钟×3次）；（12）用50%甘油封片，指甲油固定。（13）在Olympus激光共聚焦显微镜下，采集图片，每个样本随机选6个视野计算阳性细胞百分数，进行统计分析。

1.2.14.2骨组织总RNA的抽提

骨组织总RNA的提取使用北京百泰克生物技术有限公司提供的高纯总RNA快速提取试剂盒，按操作手册执行，主要方法如下：（1）将骨组织标本从液氮中取出，放入高温灭菌的研钵中，边加液氮边砸碎骨组织并充分研磨使骨组织呈粉末状，每50-100mg组织加1ml的裂解液RL；（2）将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育，静置5分钟使核蛋白体完全裂解；（3）4℃条件下12000rpm离心15分钟，吸取上清转入一个新的RNasefree的EP管中，加入1/5裂解液体积量的氯仿，剧烈震荡15秒，在室温下静置3分钟，于4℃12000rpm离心15分钟。将上层水相液转移至新的EP管中；（4）加入与上清液等体积的70%乙醇，上下颠倒离心管充分混匀，转入吸附柱RA中；（5）10000rpm离心45秒，倒掉废液，将吸附柱重新套回收集管；（6）加500μl/去蛋白液RE，12000rpm离心45秒，弃去废液；（7）加700μl/漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃去废液；（8）加500μl/漂洗液RW，12000rpm离心60秒，弃去废液；（9）将吸附柱RA放回空收集管中，12000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液；（10）取出吸附柱RA，放入一个新的RNasefree的EP管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加20-30μlDEPC水，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。测定总RNA浓度及纯度。

1.2.15WesternBlot检测

1.2.15.1组织蛋白的提取（1）从液氮中取出骨组织标本，约200mg投入研钵，加入液氮充分研磨成粉末状。（2）按每10mg加100-150μlRIPA裂解液/PMSF混合液，然后反复震荡，使蛋白充分裂解。（3）冰上裂解20-30分钟，移入1.5ml的EP管。（4）4℃，12000rpm，离心1分钟后，吸取上清，分装于新的EP管，保存于-80℃冰箱。

1.2.15.2样本蛋白浓度测定

应用碧云天公司BCA蛋白浓度测定试剂盒进行浓度测定，操作步骤按说明书进行。（1）把20mgBSA加入0.8ml蛋白标准配置液中，配制成25mg/ml的蛋白标准储备溶液。（2）应用25mg/ml的蛋白标准储备溶液将其配置成0.5mg/ml浓度的蛋白标准工作液200μl。（3）根据样本数量，按50体积BCA试剂A液加1体积B液配置BCA工作液。（4）将蛋白标准工作液0、1、2、4、8、12、16及20μl分别加入96孔板，每个剂量设置3孔，然后每孔加入标准品稀释液补足20μl。（5）骨组织蛋白样品各取1μl加入到96孔板中，在各孔中加入标准稀释液补足到20μl，每个样本设置3孔。（6）各孔均加入200μlBCA工作液，放入37℃温箱内静置30分钟。（7）将酶标仪的测定波长设定为562nm，读取光密度值。（8）应用已知蛋白标准品的浓度和OD值，作出蛋白标准曲线（图1-3）。求得线性公式y=0.0817x-0.0104，R2=0.9997。（9）把样本蛋白OD值代入公式，计算出样本的蛋白浓度。

1.2.15.3蛋白质变性处理提取的蛋白样品和上样缓冲液按1:4体积比混合后，震荡混匀，置于沸水中煮沸5分钟，按每份20μl分装，-20℃保存备用。

1.2.15.5电泳和电转

（1）样品处理：根据检测样品蛋白含量取适量蛋白样品，沸水中煮5分钟。（2）冷却至室温上样。一般留第一个孔上maker，后面的上样孔内按照设定的顺序加入蛋白样品80μg。空余孔加适量1×SDSLoadingBuffer压带。（3）接通电源，初始积层胶电泳电压40V先跑5分钟，然后调节至80V，当marker条带出现在分离胶时，调压至120V。（4）待maker条带跑到距离底部约0.5cm时，关闭电源。（5）从电泳槽里取出玻璃板置于电转液，小心取出凝胶，浸泡于电转液内。（6）按照Marker指示的位置剪下目的条带，平放于PVDF膜（使用前以甲醇浸泡1分钟）上，对齐后铺上滤纸。把夹子夹好，注意按正确的顺序（正负极）。（7）将夹子放入已加满电转液的转移槽内，在4℃冷室中，250mA（对应110V）恒流条件下转膜1-2小时。1.2.15.6免疫反应（1）转膜完成后用TBST洗膜一次，倒掉废液加适量5%脱脂奶粉，37℃摇床封闭1.5-2小时。（2）把PVDF膜从封闭液中取出，TBST洗膜三次，每次10分钟。（3）孵一抗：一抗用抗体稀释液稀释抗体，TNF-α;1:1000，RIP1:1:1000，RIP3:1:1000，β-actin:1:2000；将PVDF膜放入稀释好的抗体内，4℃冰箱过夜（＞12h）。（4）次日，在37℃温箱复温1小时,然后以TBST充分洗膜，10分钟×3次。（5）孵育二抗：应用抗体稀释液稀释二抗，山羊抗小鼠辣根过氧化物酶和山羊抗兔辣根过氧化物酶的稀释比例均是1:2000。将PVDF膜分别放入配制好的二抗稀释液内，室温摇床摇2小时。（6）取出PVDF膜，以TBST充分洗膜，10分钟×3次，TBS清洗10分钟×1次。

                                                  实验所需耗材：