关键词:免疫组织化学    HE染色    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT 

 

3.1.1人乳腺癌组织切片免疫组织化学染色

本实验中所用的人乳腺癌组织切片分别来源于中国人民解放军总医院(233例)和西安艾丽娜生物科技有限公司(139例)。

(1)染色前,首先相将待染色切片放置于恒温烘箱中55-65℃烘烤2小时(亦可以烘烤过夜),使组织与载玻片粘附更加紧密。

(2)在通风厨中事先准备好以下脱蜡试剂,包括:二甲苯I,二甲苯II,无水乙醇I,无水乙醇II,95%乙醇,80%乙醇。然后将上述经过恒温烘烤后的组织切片依稀放入脱蜡试剂进行脱蜡。流程如下:二甲苯I10min→二甲苯II10min→无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→95%乙醇10min→80%乙醇10min。脱蜡结束后,将切片放入已配制好的TBST中洗涤2-3次,每次5分钟。

(3)抗原修复,抗原修复前提前准备好抗原修复液(PH=6.4),先用微波炉的高火加热至抗原修复液沸腾,轻轻将脱蜡后的切片放入抗原修复液中,在解冻模式下进行抗原修复20min,然后冷却至室温。再用TBST洗涤3次,每次洗5分钟。

(4)抗原修复后,将切片放入3%H2O2以去除内源性的过氧化物酶,3%H2O2需现用现配,用PBS,在避光条件下配制,避光保存。15min后用TBST洗涤,每次5分钟,洗涤3次。

(5)封闭,将上述组织切片从TBST中取出,并甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,并将切片置于湿盒中,向其滴加5%的正常山羊血清(免疫组化试剂盒A液),封闭1小时。

(6)封闭结束前,用一抗稀释液按一定比例稀释好一抗,待封闭结束后,将上述组织切片取出,并甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,并将切片置于湿盒中,向其表面滴加配制好的一抗,敷好后将湿盒放于4℃,过夜孵育。

(7)孵育二抗,提前将二抗按适当的比例稀释好(或者直接用免疫组化试剂盒的B液),将组织切片从冰箱中取出,室温复温1小时后,用TBST洗涤切片2-3次,每次10min,洗涤结束后将切片从TBST中取出,甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,并将切片置于湿盒中,向其滴加配制好的二抗,室温孵育2小时。

(8)孵育三抗,二抗孵育结束后,用TBST洗涤切片2-3次,每次10min,洗涤结束后将切片从TBST中取出,甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,并将切片置于湿盒中,向其滴加HRP标记的三抗(或者免疫组化试剂盒C液),室温孵育1小时。

(9)三抗孵育结束后,用TBST洗涤切片,2-3次,每次10min,与此同时,配制DAB(DAB现用现配,避光保存),将切片从TBST中取出,甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,置于白纸上,逐一滴加DAB使其显色,该步骤应在显微镜下控制染色,并严格控制染色时间。待着色特异并且背景清晰时,将切片放入自来水中终止染色。并用TBST洗涤2-3次,每次5min。

(10)DAB染色结束后进行苏木素染核,将切片从TBST中取出,甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,向组织滴加苏木素直至覆盖全部组织,染色时间应控制在1-3min,染色结束后将切片放入自来水中终止染色,并继续用自来水流动冲洗反蓝(或者用PBS反蓝5min,自来水冲洗5min)。

(11)反蓝结束后,将切片进行脱水透明,该步骤应在通风厨中进行,在通风厨中提前准备好以下脱水试剂,包括:二甲苯I,二甲苯II,无水乙醇I,无水乙醇II,95%乙醇,80%乙醇。然后将组织切片依稀放入脱水试剂进行脱水。流程如下:80%乙醇5min→95%乙醇5min→无水乙醇I5min→无水乙醇II5min→二甲苯I5min→二甲苯II5min。

(12)组织封片,脱水结束后,将切片在通风厨中晾干,并用中性树胶封片,避免气泡产生。于显微镜下照相采图。

3.1.3HE染色

本实验对裸鼠成瘤后的肿瘤组织进行组织脱水、石蜡包埋、组织切片、HE染

色及免疫组织化学染色等操作。

1.组织脱水和包埋:

(1)将组织取出后,于4%的多聚甲醛中固定,并保存。

(2)将固定的组织从固定液中取出,待表面液体挥发干燥后,将组织放入自动

脱水仪中进行脱水(脱水条件和脱水时间取决于不同组织),本实验采用的脱水程

序如下:

70%乙醇1.5h→70%乙醇1.5h→80%乙醇0.5h→90%乙醇15min→95%

乙醇15min→95%乙醇20min→无水乙醇5min→无水乙醇5min→二甲苯I

5min→二甲苯II5min→石蜡I1.5h→石蜡II2h

(3)组织包埋,将脱水完成后的组织放入石蜡包埋机的蜡盒中,逐个进行包埋,

 

并放置在冰台上迅速冷却后,进行石蜡切片。

2.石蜡切片:

轻轻的将上述包埋好的石蜡组织块固定于石蜡切片机的样品槽内(注意锁定

样品槽,避免刀片伤手),手动调整切片机角度,并设定连续切片的厚度为5µm,

匀速切片,小心将已切下的组织完整的切片放入恒温水箱内(45℃)展片,以展

平褶皱,再用专用防脱载玻片捞片,于烤片机上烘烤,然后放入恒温烘箱内

(55-65℃)烤片过夜,室温条件下保存备用。

2.HE染色:

(1)脱蜡,脱蜡过程应在通风厨中进行,首先将选择好的切片放入切片架,并配制好脱蜡所需的各个试剂,包括:二甲苯I,二甲苯II,无水乙醇I,无水乙醇II,95%乙醇,80%乙醇。并按照以下步骤进行脱蜡:二甲苯I10min→二甲苯II10min→无水乙醇I5min→无水乙醇II10min→95%乙醇5min→80%乙醇5min→自来水5min→双蒸水2min。

(2)苏木素染核,将切片取出,甩干表面的液体,用吸水纸轻轻擦干组织周围的液体,向切片组织上滴加苏木素染色2min,并在镜下控制染色情况。

(3)为了使细胞质的着色褪去,是细胞核着色更加清楚,将上述切片与酒精盐酸中分化。只需将切片于盐酸酒精中沾2-3下,迅速放入自来水中冲洗。若本身核染色突出,细胞质无着色,也可忽略此步骤,直接进行反蓝。

(4)切片于自来水中反蓝,分别为自来水冲洗5min,再用超纯水冲洗5min。

(5)反蓝结束后进行伊红染色,伊红染色时间为1-2min,由于伊红为水溶性物质,染色结束后无需洗涤,直接进入脱水程序。

(6)脱水,脱水过程按照以下程序进行:80%乙醇沾一下→95%乙醇沾一下→无水乙醇I5min→无水乙醇II10min→二甲苯I5min→二甲苯II10min。

(7)组织封片,脱水结束后,将切片在通风厨中晾干,并用中性树胶封片,避免气泡产生。于显微镜下照相采图。

                                                实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)