激动PPARr调节RhoA活性对大鼠大脑中动脉缺血再灌注后出血转化的影响

关键词：PPARr    RhoA    大脑中动脉缺血再灌注    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT     

  1.4.2慢病毒注射

1)SD大鼠术前称体重，经腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉，固定于立体定位仪上。2)75%酒精对手术器械消毒，头部碘伏消毒备皮。3)头部正中纵性切口，长约2mm。钝性分离皮下组织。4)用3%H2O2去除筋膜，切片去除残留筋膜，清晰暴露颅骨。暴露前囟并做标记。颅骨标记处用颅骨钻钻开颅骨将固定于立体定向仪的微量注射器缓慢刺穿硬膜至相应深度（侧脑室坐标为：向右1.5mm，向后1.2mm,深度为4.5mm。右侧海马注射坐标(以前囟为0点)：向后3．5mm，右侧旁开2.5mm，深度3.0mm：右侧皮层注射坐标：向前1.2mm，右侧旁开2.0mm，深度1.5mm。）。5)微量进液器吸取慢病毒4ul。进针深度为颅骨下4.5mm。缓慢注射，注射速度为0.2ul/min，注射完成后停针5min并缓慢拔出。6)对照组以阴性对照病毒代替。7）注射完毕后缝合切口，自由进食进水。

1.4.3慢病毒载体转染有效性检测

1)右侧皮层和海马注射慢病毒载体7天后，经腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)麻醉后处死。2)立即断头取脑，PBS冲洗干净脑组织，4%多聚甲醛固定脑组织10min后转移至冰冻切片机-20°C冷冻备用。3)脑组织标本定位病毒注射点针孔处，取注射点周围脑组织，冠状位切取厚约5mm脑组织，固定于冰冻切片机标本托盘上。4)冰冻切片机连续冰冻切片，片厚约10µm，每个标本切约20张切片。5)甘油封片后在-20°C避光保存。6)共聚焦检测慢病毒载体携带绿色荧光蛋白表达。（图2.2）

1.4.4荧光定量逆转录聚合酶链式反应检测PPARγmRNA水平

1)时间点：荧光定量逆转录聚合酶链式反应（Quantitativereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR）检测梗死后26小时的各组大鼠脑内PPARγmRNA水平。2)器材消毒灭酶：为了防止外源性RNA酶干扰，用锡箔纸将器械和培养皿包裹，在250℃烤箱中高温加热3个小时以上，从而灭活RNA酶。3)取材：侧脑室注射慢病毒载体8天后，经腹腔注射10%的水合氯醛(350mg/kg)

麻醉后断头取脑。用已高温消毒的剪刀和镊子迅速取出脑组织，直接断头取脑，置于冰面上的培养皿上，取右侧大脑中动脉供血的皮质区放入灭酶EP管中，置于液氮中迅速冷冻后转移-80℃冰箱中保存，4)将已冻存组织于室温放置5min使其完全溶解。5)100mg组织加入1mlTrizol裂解液，无酶匀浆器匀浆充分裂解。6)两相分离：加入0.2ml氯仿轻微晃动混匀后静置5min，4℃，12000rpm离心15min，提取无色水相。7)加入与水相等体积的异丙醇晃动混合10min，4℃低温，12000rpm离心10min，吸取管底部白色胶状沉淀块。8)移去上清液，加入至少1ml75%无酶乙醇清洗RNA沉淀，混匀4℃，7000rpm离心5min。9)吸去无酶乙醇，空气中干燥3-5min。10)加入RNA无酶水30μl反复吹打，使其完全溶解，获得的RNA保存于-80℃标注备用。11)进行RNA浓度测量，RNA纯度比值范围为1.8-2.1。12)制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为92℃2min，93℃1min，55℃2min，共40个循环。13)自动分析Ct值。结果以相对表达定量（RQ，RelativeQuantity）表示，RQ=2-CT。CT=待测样本的CT对照样本的CT，CT=目的基因的CT值-对照基因CT。

                                                  实验所需耗材：