关键词:超声靶向破坏    CD133-shRNA    CD133+    肝癌干细胞    超声检查    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

1.2.2CD133+SMMC-7721细胞流式细胞分选(FACS)及培养

1.流式细胞分选获取CD133+SMMC-7721细胞

细胞经流式分选后需再培养,因此整个操作过程必需注意无菌。步骤如下:(1)进行流式分选细胞实验的前日,紫外照射流式细胞室消毒至少10小时;分选前,紫外照射流式细胞分选仪器操作间消毒30min,75%酒精消毒操作台;75%酒精冲洗液体管道30min;再用无菌蒸馏水冲洗30min;开机调整数据准备流式分选。(2)0.125%胰酶消化收集SMMC-7721细胞至灭菌的EP管中,500rpm离心5min;弃上清液后用含1%FBS的PBS重悬细胞;500rpm再次离心5min,小心倒掉上清液后,用DMEM重悬细胞,轻柔吹打混匀,使细胞呈单个悬浮;(3)将细胞计数板置于显微镜下,计算细胞密度,再调整细胞浓度至107/ml;(4)分别加入1:10稀释的抗人CD133-PE抗体和同型对照抗体PE-MouseIgG2b抗体避光孵育30min。立即进行流式细胞仪检测并分选。2.CD133+SMMC-7721细胞培养及传代(1)CD133+SMMC-7721细胞培养将上述分选后的CD133+SMMC-7721细胞收集,离心,将细胞接种至超低吸附6孔细胞培养板中,加入适量含生长因子的干细胞培养基,置于37°C,5%C02孵箱培养。每隔2天加进新鲜的干细胞培养基1ml,直到细胞球生长至直径约50μm大小。(2)CD133+SMMC-7721细胞传代收集上述直径约50μm大小的肝癌细胞至离心管中,500rpm离心5min,小心用无菌枪头吸去上清,加入Accutase细胞消化液消化细胞,轻柔吹打成单个细胞悬液,800rpm离心5min后弃上清,计数,将重新悬浮于干细胞培养基中的细胞接种至超低吸附6孔板中继续培养。

1.2.3CD133+SMMC-7721细胞干细胞特性的鉴定

1.悬浮细胞球形成实验(1)用75%酒精消毒超净台,实验用具摆放好后紫外线照射灭菌30min;(2)分选后的CD133+和CD133-SMMC-7721细胞计数并调整细胞浓度,以1×103/孔分别接种于超低吸附六孔板中,给予含生长因子的DMEM/F12培养基,置于37℃,5%C02孵箱中培养。每隔3天半量换液,每天在显微镜下观察孔板中细胞生长情况。

2.细胞增殖实验(1)分选后的CD133+SMMC-7721及CD133-SMMC-7721细胞经离心重悬成单个细胞悬液,并调整细胞浓度至1×104/ml;(2)分别接种于96孔板中,每孔200μl,各组细胞设置3个复孔,并设空白孔进行对照调零,置于恒温培养箱中中静置培养。(3)分别在0d,1d,2d,3d,4d和5d,每孔加入10μl的CCK-8试剂后置于培养箱继续培养4h。(4)在酶标仪上测定450nm波长处吸光度值,读取各时间点细胞吸光度的平均值,以吸光度(A450)平均值为纵坐标,时间(d)为横坐标,来绘制细胞生长曲线。

3.裸鼠皮下成瘤实验(1)将流式分选的CD133+SMMC-7721及CD133-SMMC-7721细胞分别用计数板计数,调整细胞密度并用PBS重悬成不同浓度梯度的细胞悬液1×l02/200μl,1×l03/200μl,1×104/200μl备用;(2)把裸鼠随机分成三组,每组5只,消毒接种部位皮肤,以1×l02/只、1×l03/只、1×104/只的密度梯度接种到裸鼠双侧后肢皮下。左侧后肢皮下接种CD133+SMMC-7721细胞,右侧后肢皮下注射CD133-SMMC-7721细胞。(3)每隔一天观察裸鼠接种部位成瘤情况,游标卡尺测量肿瘤大小并做记录。

六周后处死裸鼠,统计各组细胞的成瘤情况。

1.2.4超声靶向微泡介导基因转染

1.细胞准备转染前,收集CD133+SMMC-7721细胞并计数,按1×105/孔浓度接种于六孔培养板,以新鲜的含生长因子的干细胞培养液在标准环境下培养。次日行目的基因转染。

2.质粒的转化与抽提质粒转化步骤如下:将重组质粒1μl加至100μlE.coliDH5α冰浴上融化的感受态细胞中,混匀后冰浴30min,42℃水浴热激90s后,迅速将管放回至冰上冰浴2min,此过程中不要晃动离心管。离心管中加入900μlLB培养基,混匀后置于37℃,200rpm振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的LB培养基上,37℃倒置过夜培养,挑选生长良好的菌落。质粒抽提步骤如下:(1)取过夜培养的菌液,8000rpm离心5min,弃上清尽量倒干收集菌液;(2)加入9ml溶液P1重悬菌液,吹打使其彻底悬浮;加入9ml溶液P2,温和上下翻转6-8次后,室温静置5min至溶液清亮;(3)加入14ml溶液P3,轻柔上下翻转6-8次后,充分混合溶液中出现白色的絮状沉淀,室温静置10min,8000rpm离心10min,小心取上清。(4)上清液加入吸附柱中,1000rpm离心3min,弃滤液直至全部过滤完毕。(5)加入10ml异丙醇,8000rpm离心5min,弃废液。(6)将10ml的漂洗液PW(加入无水乙醇)8000rpm离心3min,弃废液,重复漂洗一次;(7)取出吸附柱放置于干净的收集管中,在吸附膜的中间位置加1.5ml的洗脱缓冲液TB,室温静置3min,室温13,000rpm离心3min,收集下滤液。空气干燥10分钟,加入TE重溶。(8)运用分光光度计测定质粒浓度(1μg/μl)和纯度,E260/E280≥1.8时用于实验。(9)DNA贮存于-20℃备用。3.转染设计(1)细胞随机分为三组,分别采用质粒+脂质体(P+L组)和质粒+超声微泡(P+UTMD组)转染目的基因,非转染组为空白对照组(contol组)。每组重复6孔。(2)依据LiPofectamineTM2000(LF2000)转染试剂说明书,六孔板上每孔加入质粒DNA4.0μg。(3)参考相关文献及前期实验,超声辐射条件设定为:1MHz,1W/cm2,作用时间为30s。

4.LF2000/DNA混合物的制备(1)250μlDMEM/F12培养液稀释4.0μg质粒DNA,轻柔混匀。(2)250μlDMEM/F12培养液稀释10μ1LF2000,轻柔混匀,室温孵育5min。(3)将500mlDNA与LF2000轻柔混匀,室温孵育20min。5.声诺维/DNA混合物的制备采用意大利Bracco公司的超声造影剂声诺维,使用前注入生理盐水5ml和质粒,使质粒DNA终浓度为0.02mg/ml。震荡混匀,孵育30min。6.转染(1)质粒+脂质体组(P+L组):参照LP2000转染说明,将4.0μg质粒DNA和10μ1LF2000分别加入到250μlDMEM/F12培养液中,轻柔混匀后室温孵育20min,摇匀后滴加到六孔板的单孔中,补加DMEM/F12培养液至2ml,标准环境下培养4-6h后更换新鲜干细胞培养液。(2)质粒+超声微泡组(P+UTMD组):每孔加入声诺维/DNA混合物200μl,补加DMEM/F12培养液至2ml,在1MHz,1W/cm2条件下超声辐照30s,标准环境下培养3h后更换新鲜干细胞培养液。

1.2.5转染效率的检测

1.荧光显微镜下观察GFP表达情况转染细胞在培养12h、24h、48h后,运用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况,首先在光镜视野下观察细胞生长情况,然后切换到绿色荧光状态,观察细胞中的转染表达情况,随机选择较佳视野进行拍照。2.流式细胞仪检测转染效率转染48h后离心收集各组细胞,PBS洗涤细胞2次,调整浓度约5×105/ml,细胞重悬收集于1mlPBS中,标记后将EP管送流式细胞仪分析检测各组细胞荧光蛋白的表达比例。

2.细胞RNA的提取(1)超净台中摆放好实验所需器材及试剂,紫外灯照射约30min。(2)离心收集各组细胞,PBS洗涤细胞2次,弃废液;按照六孔板每孔约加1ml裂解液的量加入RNAisoPlus,用1ml移液器反复吹打细胞,至裂解液中无明显沉淀;(3)用移液枪将各组细胞的裂解液分别收集至1.5mlEP管中,各管注意编号;加入总体积1/5的氯仿,涡旋器上振荡15s,待管内液体充分乳化后,室温静置5min。(4)4℃离心机内离心15min,转速为12000rpm;(5)从离心机内取出EP管,可见EP管内匀浆液分为三层:(上层)无色上清液、(中间)白色蛋白层及(下层)带颜色的有机层,小心吸取无色上清液转移至另一新的EP管中,各管标号。(6)加入等体积的异丙醇,涡旋器上充分混匀,室温静置10min;(7)4℃离心机内离心10min,转速12000rpm;(8)取出EP管后小心吸弃上清液,勿触及管底少许白色沉淀,沿管壁缓慢加入75%乙醇1ml,小心上下颠倒洗涤;(9)4℃离心机内离心5min,转速12000rpm;(10)在不触及管底沉淀前提下小心弃除乙醇,室温下干燥5-10min;(11)向EP管中加入适量RNase-free水溶解沉淀,紫外分光光度计测取RNA浓度;标记样本及日期并保存于-80℃冰箱中,或立即进行逆转录。整个操作注意戴一次性手套,溶液需用DEPC水配制。枪头、EP管等均需灭酶。防止RNA酶污染样品。

1.2.7Westernblot定性检测CD133蛋白表达

1.细胞总蛋白的提取(1)离心收集悬浮细胞,使用预冷的PBS洗涤细胞2次。(2)按照六孔板每孔约加100μl裂解液的量加入裂解液,用移液器反复吹打2min。(3)将裂解产物转移至EP管中并置于冰上,每隔5min振荡一次,共孵育30分钟,使裂解液充分裂解细胞。(4)4℃离心机离心15min,转速为12500rpm,收集上清液,即为细胞总蛋白。(5)取少量上清用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白浓度测定并绘制浓度标准曲线。(6)加入5×上样缓冲液混合后,于沸水中煮10min,冷却后分装置于-20℃冰箱保存,如需长期保存置于-80℃。2.SDS-PAGE电泳、转膜及ECL发光操作(1)封闭胶槽,制胶用玻璃板及上样梳子等应用肥皂水洗刷干净并干燥后行封闭胶槽。(2)配胶。配制按10%分离胶15ml,方案如下:H2O4.0ml,30%A/B5.0ml,PH8.81.0MTris-HCL5.7ml,10%SDS0.15ml,10%AP0.15ml,TEMED0.006ml。配制0.5%浓缩胶7ml,方案如下:H2O4.78ml,30%A/B1.17ml,PH6.81.0MTris-HCL0.875ml,10%SDS0.07ml,10%AP0.07ml,TEMED0.007ml。(3)灌制分离胶。用1ml移液器沿胶槽边快速注入分离胶,两侧分离胶的体积应保持一致,灌注过程中主要不要产生气泡。灌制完毕后,在其上加入1ml的无水乙醇,以防止胶面被氧化,然后放入37℃温箱使其凝固。(4)灌制浓缩胶。分离胶凝固后弃去上层无水乙醇,用1ml移液器沿胶槽边快速注入浓缩胶,沿水平方向将梳子轻轻插入,注意谨防产生气泡。(5)蛋白样品煮沸10min后离心,并放置于37℃的水浴箱中来备用。(6)浓缩胶凝固后,将灌胶支架放入电泳槽中,缓慢倒入电泳液后拔掉胶条。(7)上样。按照上样蛋白量为50μg计算上样体积,蛋白Marker的上样量为3μl,用1×上样buffer补足成等体积。(8)电泳。先选择80V恒压模式,待上样缓冲液移动至浓缩胶与分离胶分界处时,将电压调整至100V。待蛋白Marker的各条带彻底分离时,终止电泳。(9)切胶。电泳结束后,取出胶板,根据目的蛋白的大小,对比marker的相应位置,切下所要胶条置于1×电转液中。(10)电转前准备:依据胶条大小裁剪PVDF膜,放于甲醇中2min后移入电转液中浸泡;按胶条大小拆剪滤纸(3张叠在一起)浸泡于电转液中,长及宽均较PVDF膜短2mm。(11)电转。夹子打开,将黑的一面放置水平,其上放垫置一张海绵垫,在海绵垫上放置三层滤纸,第3层置放胶条,第4层放置PVDF膜,第5层放上3层滤纸,第6层为海绵垫。海绵垫及各层之间注意用1ml枪头轻柔碾压擀走气泡。将夹子放入电转槽内,使夹子黑色面对应槽的黑面。电转槽放置于在冰中电转,转膜时间依据目的蛋白分子量而定。(12)转膜完,取出PVDF膜,将其放入电转液中漂洗几分钟。然后将膜置于5%的脱脂牛奶中,摇床封闭1h。(13)抗体的准备。根据抗体说明书要求用抗体稀释液稀释抗体。兔抗人CD133抗体稀释比例1:2000,兔抗人β-actin稀释比例1:5000。山羊抗兔二抗稀释比例1:5000。(14)一抗的孵育。将PVDF膜正面朝下浸入加有一抗的抗体孵育盒中,4ºC过夜。(15)取出一抗,TBST漂洗3次,每次计时为5min。(16)二抗的孵育。将PVDF膜正面朝下浸入加有二抗的抗体孵育盒中,37℃温箱中孵育1h。(17)取出二抗,TBST清洗3次,每次计时为5min。(18)ECL发光。按ECL发光试剂盒说明书要求,取等量A液、B液,充分混匀配置发光液。滤纸吸干PVDF膜,放入石蜡填平的培养皿中,移液枪加入适量发光液,在凝胶成像系统上进行显影,再用Quantityone软件进行结果分析。

                                                   实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)