FAT/CD36KO小鼠原代肝细胞脂质积聚和损害相关指标的观察

关键词：FAT    CD36KO    原代肝细胞    脂质积聚    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

1.2方法

1.2.1原代肝细胞分离

（1）操作时戴一次性口罩和帽子，手术器械高温高压消毒后使用。向小鼠腹腔内注射0.2ml1000units/ml肝素,待5min后腹腔注射0.2ml2%戊巴比妥溶液。待小鼠麻醉后，用75%酒精将小鼠进行消毒并固定好；

（2）在无菌条件下打开腹腔和胸腔，用医用留置针穿刺下腔静脉肝下段，进针至近肝脏处（约2mm）并退出针芯，剪断门静脉，用蠕动泵将1号灌注液以14rpm（约3.6ml/min）的速度灌注2min。用医用丝线结扎下腔静脉肝上段，继续灌注1号灌注液，速度为8rpm（约2.1ml/min)。至少13min后（可根据灌注效果延长时间，但不要超过20min）看见肝脏颜色变为土黄甚至偏白，换为2号灌注液，速度为6rpm（约1.8ml/mim)；

（3）等肝脏质地变软（通常灌注2号灌注液10min后），眼科镊轻压肝脏有压痕并且不易恢复原状。继续灌注甚至能看出肝包膜下的肝脏实质已消化成分散状后（再5min），小心取下肝脏（注意不要弄破胆囊），转移到已加入了4°C预冷洗液中，去除胆囊，轻轻撕开肝脏包膜，轻摇肝脏，肝细胞便呈流沙样流出；

（4）将所得的肝细胞悬液用100-μm细胞滤器进行过滤后，经500rpm/min,2min的离心条件离心3次后，用培养基重悬；

（5）取少量细胞悬液做台盼蓝染色；

（6）将细胞悬液以适当浓度接种于培养瓶或培养皿中，放入37°C、5%CO2孵箱中培养。

1.2.2小鼠原代肝细胞活率的检测（台盼蓝染色）

（1）血细胞计数板及盖片备好；

（2）将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以体积比1:1混合（动作轻柔），通常各50ul；

（3）将混合悬液滴至计数板和盖片空隙中，放置到显微镜下进行观察；

（4）蓝色为死细胞，不着色为活细胞。（部分细胞在分离时细胞膜有损伤，可呈淡蓝色，种板后24h内可恢复）细胞活率=活细胞/（活细胞+死细胞）×100%。

1.2.3原代肝细胞培养与分组

分离WT和CD36KO小鼠原代肝细胞后，根据细胞活率种板，种板4h后换液。此后每24h换液一次。待种板至少3天细胞形态稳定后（至多5天），给予24h的含0.2%BSA的无血清培养基培养。再按照以下处理分为3个组：（1）对照组（Control）：0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸；（2）TNF-α处理组（TNF-α）：0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+25ng/mLTNF-α；（3）IL-6处理组（IL-6）：0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+20ng/mLIL-6。处理时间达24小时后收集原代肝细胞进行下一步检测。

1.2.4原代肝细胞FFA摄取动态观察方法

（1）将分离的两种原代细胞接种于同一个24孔板中，3h后换液。

（2）细胞培养3天后无血清培养基饥饿处理24h，不以PA培养为背景，炎症因子处理24h后，开始实验。

（3）照相前去除培养基，PBS洗3次。

（4）于照相0s开始，加入浓度为0.02mMBODIPYFLC16250ul，荧光显微镜下excitation/emission=505nm/510nm，每隔4s照相一次，共观察5min，收集保存图片。

                                                      实验所需耗材：