关键词:FAT    CD36KO    原代肝细胞    脂质积聚    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

1.2方法

1.2.1原代肝细胞分离

(1)操作时戴一次性口罩和帽子,手术器械高温高压消毒后使用。向小鼠腹腔内注射0.2ml1000units/ml肝素,待5min后腹腔注射0.2ml2%戊巴比妥溶液。待小鼠麻醉后,用75%酒精将小鼠进行消毒并固定好;

(2)在无菌条件下打开腹腔和胸腔,用医用留置针穿刺下腔静脉肝下段,进针至近肝脏处(约2mm)并退出针芯,剪断门静脉,用蠕动泵将1号灌注液以14rpm(约3.6ml/min)的速度灌注2min。用医用丝线结扎下腔静脉肝上段,继续灌注1号灌注液,速度为8rpm(约2.1ml/min)。至少13min后(可根据灌注效果延长时间,但不要超过20min)看见肝脏颜色变为土黄甚至偏白,换为2号灌注液,速度为6rpm(约1.8ml/mim);

(3)等肝脏质地变软(通常灌注2号灌注液10min后),眼科镊轻压肝脏有压痕并且不易恢复原状。继续灌注甚至能看出肝包膜下的肝脏实质已消化成分散状后(再5min),小心取下肝脏(注意不要弄破胆囊),转移到已加入了4°C预冷洗液中,去除胆囊,轻轻撕开肝脏包膜,轻摇肝脏,肝细胞便呈流沙样流出;

(4)将所得的肝细胞悬液用100-μm细胞滤器进行过滤后,经500rpm/min,2min的离心条件离心3次后,用培养基重悬;

(5)取少量细胞悬液做台盼蓝染色;

(6)将细胞悬液以适当浓度接种于培养瓶或培养皿中,放入37°C、5%CO2孵箱中培养。

1.2.2小鼠原代肝细胞活率的检测(台盼蓝染色)

(1)血细胞计数板及盖片备好;

(2)将细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以体积比1:1混合(动作轻柔),通常各50ul;

(3)将混合悬液滴至计数板和盖片空隙中,放置到显微镜下进行观察;

(4)蓝色为死细胞,不着色为活细胞。(部分细胞在分离时细胞膜有损伤,可呈淡蓝色,种板后24h内可恢复)细胞活率=活细胞/(活细胞+死细胞)×100%。

1.2.3原代肝细胞培养与分组

分离WT和CD36KO小鼠原代肝细胞后,根据细胞活率种板,种板4h后换液。此后每24h换液一次。待种板至少3天细胞形态稳定后(至多5天),给予24h的含0.2%BSA的无血清培养基培养。再按照以下处理分为3个组:(1)对照组(Control):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸;(2)TNF-α处理组(TNF-α):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+25ng/mLTNF-α;(3)IL-6处理组(IL-6):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+20ng/mLIL-6。处理时间达24小时后收集原代肝细胞进行下一步检测。

1.2.4原代肝细胞FFA摄取动态观察方法

(1)将分离的两种原代细胞接种于同一个24孔板中,3h后换液。

(2)细胞培养3天后无血清培养基饥饿处理24h,不以PA培养为背景,炎症因子处理24h后,开始实验。

(3)照相前去除培养基,PBS洗3次。

(4)于照相0s开始,加入浓度为0.02mMBODIPYFLC16250ul,荧光显微镜下excitation/emission=505nm/510nm,每隔4s照相一次,共观察5min,收集保存图片。

                                                      实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)