关键词:FAT    CD36     HepG2细胞    脂质积聚    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT    

 

1.2方法

1.2.1CD36SiRNA瞬时转染方法和细胞培养分组

将液氮冻存的HepG2细胞复苏以后,用含有10%胎牛血清加入100U/mL青霉素及100µg/mL链霉素的DMEM高糖(不含丙酮酸钠)培养基,置于37℃5%CO2培养箱中培养。传至第三至五代后,当细胞融合度到30%到50%左右时进行瞬时转染。

(1)种板:转染前一天,以最适密度0.8或3×105将细胞接种于24孔板或6孔板,根据面积不同调整细胞数量,无抗生素细胞生长培养基每孔体积为450ul,转染时细胞状态很重要,种板需均匀,放入培养箱37℃,5%CO2培养24h;

(2)根据罗氏siRNA转染试剂X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent推荐最佳转染细胞融合度为30—50%;

(3)配制转染复合物:分别取两个1.5mlEP管A与B,A管须先加入Opti-MEM,之后加入转染试剂,未稀释的转染试剂不能触碰管壁,应直接加入Opti-MEM内混匀。B管中加入Opti-MEM与siRNA的混合物,同样,B管也须先加入Opti-MEM,用去RNA酶的枪头吸取siRNA溶液,同样未稀释的siRNA溶液不能触碰管壁,应直接加入Opti-MEM内混匀。Opti-MEM与siRNA的用量根据细胞培养板的变化而变化。之后A管与B管混匀,静置20min;

(4)转染之前,细胞换液。静置20分钟后,将转染复合物逐滴加入每孔内,轻轻摇匀,放入孵箱继续生长;

(6)转染12h后更换培养基,弃转染培养基,加入实验培养基(0.2%BSA)饥饿处理12h,再按照以下处理分为3个组:(1)对照组(Control):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸;(2)TNF-α处理组(TNF-α):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+25ng/mLTNF-α;(3)IL-6处理组(IL-6):0.2%BSA+0.04mmol/L软脂酸+20ng/mLIL-6。处理时间达24小时后收集HepG2细胞进行进一步检测。

1.2.2CD36OE细胞瞬时转染方法及分组

(1)种板:转染前20分钟,以最适密度0.8或3×105将细胞接种于24孔板或6孔板,根据面积不同调整细胞数量,无抗细胞生长培养基每孔体积为450ul,种板均匀,放入培养箱37℃,5%CO2培养;

(2)将转染试剂和pCDNA3.1-CD36-BFP及对照空质粒从冰箱拿出,瞬时离心;

(3)配制转染复合物:取1.5mlEP管1个,加入Opti-MEM、转染试剂及DNA混匀(各组分用量根据细胞培养板的不同而变化),室温静置15min;

(4)静置时间到后,将转染复合物逐滴加入每孔内,轻轻摇匀,放入孵箱继续生长;

(5)细胞分组:对照组为阴性转染细胞(Victor),实验组为CD36超表达细胞(CD36OE)组,均在高脂肪酸(0.04μmol/l)为背景的条件下;

(6)转染12h后,再饥饿处理12h,然后再用炎症因子处理24h即可收集细胞用于实验。

1.2.3HepG2细胞FFA动态观察方法

(1)将细胞接种于24孔培养板中,20分钟后转染细胞;

(2)细胞转染12h后无血清培养基饥饿处理12h,不以PA培养为背景,炎症因子处理24h后,开始实验;

(3)照相前去除培养基,PBS洗3次;

(4)于照相0s开始,加入浓度为0.02mMBODIPYFLC16,荧光显微镜下

excitation/emission=505nm/510nm,每隔4s照相一次,共观察5min,收集保存图片。

                                                   实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)