关键词:1,25(OH)2D3    高糖介导      肾小球系膜细胞     科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

2.3.5Lenti-shVDR序列的筛选

1)按以上方法把含有4条干扰序列的Lenti-shVDR分别转染入HBZY-1细胞中。

2)RT-PCR分别检测转染4条序列的HBZY-1细胞中VDR的mRNA表达水平

①收集处于对数生长期的HBZY-1细胞。重悬离心,弃上清。加入适量RNAisoPlus裂解细胞,室温静置10分钟。加入裂解液1/5体积的氯仿,涡旋震荡器上混匀。室温静置5分钟后,于低温离心机12000g4℃离心15分钟。吸取上清于新的1.5ml无酶EP管中,加入裂解液1/2体积的异丙醇,室温静置10分钟后,于低温离心机12000g4℃离心10分钟,弃上清。用与裂解液等体积的75%乙醇洗涤白色沉淀,7500g4℃离心5分钟,弃上清。自然风干后加适量DEPC水稀释,放入-80℃冰箱长期保持。

②超微量核酸测量仪检测各样品RNA浓度。

③TaKaRa试剂盒逆转录RNA为cDNA

步骤1:去除基因组DNA。5×gDNAEraserBuffer2μl,gDNAEraser1μl,总RNA1μg,加RnaseFreedH2O补足10μl,室温放置5分钟。

步骤2:步骤1的反应液分别加入PrimeScriptRTEnzymeMix11μl,RTPrimerMix1μl,5×PrimeScriptBuffer2(forRealtime)4μl,RnaseFreedH2O4μl。37℃15分钟,85℃5秒,降温至4℃,-20℃长期保存。

④RealTime-PCR(RT-PCR):稀释cDNA10倍,稀释引物至10μM。10μl反应体系:SYBRGreen5μl,上游引物0.3μl,下游引物0.3μl,RnaseFreedH2O2.4μl,cDNA2μl。上机,95℃30秒预变性,95℃5秒,60℃30秒扩增,循环40次。2ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

3)westernblot分别检测转染4条序列的HBZY-1细胞中VDR的蛋白表达水平

①细胞蛋白提取:收集对数生长期的HBZY-1细胞,冰PBS洗涤2次后,加入Rapa和PMSF按50:1比例混合的裂解液,把细胞与裂解液的混合悬液收集入1.5ml的EP管中,置于冰上5分钟,再置于涡旋震荡器上30秒,以上过程重复5次,使细胞裂解充分。然后把EP管放入低温离心机中,4℃14000rpm离心15分钟,吸取上清液至另一EP管中备用。②BCA法测蛋白浓度:根据beyotimeBCA试剂盒说明书配置蛋白标准品。分别向96孔板中依次添加蛋白标准品0μl、1μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl作为标准曲线。然后向每孔中添加2μl蛋白原液,不满20μl的孔用PBS补足。然后向每孔中添加由A液与B液按50:1混合的工作液200μl,37℃孵育30分钟,置于酶标仪上读取每孔OD值。根据标准曲线OD值生成曲线公式,然后用公式计算出每孔蛋白浓度。③蛋白浓度配平:根据测量出的每个样品蛋白浓度,分别向EP管中加入计算好的相应体积的蛋白原液、loadingbuffer和Rapa,使每个样品的蛋白浓度一致。然后置于沸水中8分钟,使蛋白充分变性,于-80℃保存。④SDS-PAGE胶制备分离胶:根据beyotime配胶试剂盒说明书,向50ml离心管中依次加入超纯水、30%Acr-Bis、1MTris-HCl(pH8.8)、10%SDS、Ammoniumpersulfate及TEMED,混合均匀后灌入制胶器两块玻璃板间隙中,直至液面上端距玻璃板顶端约2cm处。然后在分离胶上方灌满无水乙醇以压平液面并隔绝空气。静置30分钟待分离胶完全凝固后,吸去无水乙醇,超纯水清洗凝胶顶部3次,晾干备用。浓缩胶:根据beyotime配胶试剂盒说明书,向50ml离心管中依次加入超纯水、30%Acr-Bis、1MTris-HCl(pH6.8)、10%SDS、Ammoniumpersulfate及TEMED,混合均匀后灌满分离胶上方。将bio-rad梳齿插入浓缩胶中,避免产生气泡,如有溢出需补充少量浓缩胶至制胶器玻板间无空隙。静置约30分钟待浓缩胶凝固。⑤蛋白样品上样:把蛋白样品从-80℃冰箱中取出,置于沸水中复温5分钟。把配好胶的玻板移入电泳槽中,注满电泳液以保持胶体湿润。小心拔出浓缩胶中的梳齿,用微量加样器向每个齿孔中依次加入蛋白样品20μl。⑥蛋白电泳:接通电泳槽电源,调整电源模式为恒压100V,电泳90分钟。⑦转膜:切割滤纸及PVDF膜,使其大小与凝胶匹配(长8cm,高6cm)。PVDF膜切割好后标记蛋白面,置于甲醇中5秒,TBST3分钟,转膜液15分钟。滤纸切割好后置于转膜液中。凝胶电泳完后置于TBST中。向医用无菌盘中倒入少量转膜液,在其中由下向上依次向转膜夹中放入海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵。把转膜夹卡紧放入转膜槽中,注满转膜液,并放入冰盒。接通转膜槽电源,调整电源模式为恒压100V,4℃环境转膜90分钟。⑧封闭:转膜完成后,取出PVDF膜。TBST洗涤3次(每次5分钟)后,浸泡于封闭液中,室温下摇床上封闭2小时。⑨抗体孵育:封闭完成后,取出PVDF膜。TBST洗涤3次(每次5分钟)后,置于抗体孵育盒中,加入一抗,4℃摇床孵育12-18小时。一抗孵育后,TBST洗涤3次(每次5分钟),加入二抗,室温静置孵育60分钟。⑩ECL显影:二抗孵育完后用TBST洗涤PVDF膜3次(每次5分钟)。在暗室中取出ECL显影剂A、B液,按PVDF膜面积0.1-0.2ml/cm2比例,A、B液等体积配制显影剂并混匀。用滤纸吸干PVDF膜,置于显影剂中充分润湿,放入凝胶成像系统显影。⑪摄片,图像分析并定量。

2.3.4Lenti-shVDR转染HBZY-1细胞

1)收集对处于数生长期的HBZY-1细胞,用含10%胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液,并以1×106/ml细胞浓度接种于6孔培养板中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下进行培养。

2)孵育12h后,更换新的培养基,向每孔培养基中分别加入病毒滴度为MOI0(0/ml)、MOI1(1×106/ml)、MOI10(1×107/ml)、MOI30(3×107/ml)、MOI50(5×107/ml)及MOI100(1×108/ml)的Lenti-shVDR及polybrene,共孵育12h。12小时后,观察细胞状态,如无大量漂浮死亡,可延长转染时间至24h。病毒转染完后,更换新的培养基孵育细胞,荧光显微镜下摄片观察病毒转染效果。

3)向转染病毒的细胞培养基中按10μg/ml加入嘌呤霉素(puromycin),与未转染细胞作对比。筛选转染HBZY-1细胞慢病毒的最佳MOI。

4)确定最佳转染MOI后,分别在1、3、5、7天进行细胞计数,观察慢病毒对HBZY-1细胞生长的影响。

FAT/CD36在炎症应激状态下肝脏脂质积聚和损害中的作用研究

1.2.2ELISA检测游离脂肪酸含量

(1)HepG2细胞按上述分组处理达24小时后,彻底吸去孔内的培养基,PBS洗涤2次后,收集细胞至1.5mLEP管中;

(2)1000g,离心5min;

(3)向细胞沉淀中加入1mL有机溶剂(正庚烷:异丙醇=2:3.5);

(4)用超声破碎仪破碎细胞,仪器参数设置如下:能量21%,总时间2分钟,放电时间1秒,暂停时间1秒;

(5)将样品放入空气恒温摇床中,200rpm振摇15分钟后,9000rpm离心10分钟;

(6)吸取上层含有脂质成分的有机液相至1.5mLEP管中,用真空浓缩仪干燥1~1.5小时,加入200µL有机溶剂反复吹打震荡直至完全溶解;

(7)下层含有蛋白成分的白色沉淀放置于室温干燥15分钟,加入适量1MNaOH反复吹打震荡直至完全溶解;

(8)使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测各样本的蛋白总量:将试剂A与试剂B按50:1混合配制成BCA工作液,将0、1、2、4、6、8、10µL蛋白标准品分别加入96孔板中,将10µL待测样品分别加入96孔板中,每个蛋白标准品及待测样品均做2个复孔,将200µLBCA工作液加入各孔中,放置于37℃恒温孵箱中反应30分钟,使用酶标仪检测各孔562nm波长下的吸光度值,绘制标准曲线并计算各个样品的蛋白总量;

(9)使用人游离脂肪酸(FFA)ELISA检测试剂盒检测HepG2细胞FFA,将各种试剂放至室温平衡30分钟;

(10)配制倍比稀释标准品:将标准品10000rpm离心30秒,加入1mL样本稀释液反复吹打震荡使其充分混匀得到标准品S7,取出7个1.5mLEP管(S6~S0),分别加入250µL样本稀释液,吸取250µL标准品S7到第一个EP管中(S6)反复吹打震荡使其充分混匀,吸取250µL标准品S6到第二个EP管中(S5)反复吹打震荡使其充分混匀,以此类推将标准品倍比稀释,S0为样本稀释液。标准品S7~S0的FFA浓度分别为2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0ng/mL;

(11)将100µL标准品及待测样本分别加入预包被的酶标板中,轻轻摇晃混匀后贴上板贴,放置于37℃孵箱孵育2小时;

(12)提前半小时配制生物素标记抗体工作液:将100µL生物素标记抗体加入9900µL生物素标记抗体稀释液,轻轻混匀;

(13)彻底甩干酶标板内的液体,每孔加入100µL生物素标记抗体工作液,贴上新的板贴,放置于37℃孵箱孵育1小时;

(14)配制洗涤工作液:将10mL浓洗涤液加入240mLddH2O中,搅拌混匀,提前15分钟配制;

(15)配制辣根过氧化物酶标记亲和素工作液:将100µL辣根过氧化物酶标记亲和素加入9900µL辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液,轻轻混匀;提前20分钟配制;

(16)彻底甩干酶标板内的液体,每孔加入200µL洗涤工作液,洗板3次每次浸泡2分钟;

(17)彻底甩干酶标板内的液体,每孔加入100µL辣根过氧化物酶标记亲和素工作液,贴上新的板贴,放置于37℃孵箱孵育1小时;

(18)彻底甩干酶标板内的液体,每孔加入200µL洗涤工作液,洗板5次每次浸泡2分钟;

(19)彻底甩干酶标板内的液体,每孔加入90µL底物溶液,放置于37℃孵箱避光显色15~30分钟;

(20)每孔加入50µL终止液终止反应;

(21)5分钟内使用酶标仪检测各孔450nm波长下的吸光度值,绘制标准曲线并计算各个待测样品的FFA总量;

(22)根据测得FFA总量及蛋白总量计算出各个HepG2细胞样本FFA含量。

1.2.3酶偶联比色法检测甘油三酯含量

(1)按照同前方法提取HepG2细胞脂质成分并计算出各个样品的蛋白总量;

(2)使用酶偶联比色法甘油三酯(TG)测定试剂盒检测HepG2细胞TG含量;

(3)配制倍比稀释标准品:将200mg/dL校准品用有机溶剂倍比稀释,获得浓度分别为200、100、50、25、12.5、6.25、0mg/dL的校准品;

(4)将2µl校准品及待测样本分别加入96孔板中,各孔分别加入200µL检测试剂,轻轻摇晃后放置于37℃孵箱孵育5分钟;

(5)使用酶标仪检测各孔546nm波长下的吸光度值,绘制标准曲线并计算各个待测样品的TG总量;

(6)根据测得TG总量及蛋白总量计算出各组HepG2细胞TG含量。

1.2.8H2O2检测

根据H2O2检测试剂盒说明书步骤进行:

(1)HepG2细胞按上述分组处理达24小时后,彻底吸弃孔内的培养基,冷PBS洗涤2次后,收集细胞至1.5mLEP管中;

(2)1000g,离心5min,弃上清;

(3)加入200ul裂解液进行匀浆,低温高速离心,4℃,12000g,5min,吸取上清转入另一干净EP管内,沉淀用于蛋白浓度检测;

(4)不同浓度标准液制备:取7个EP管,分别编号1、2、3、4、5、6、7,按照顺序依次稀释成1、2、5、10、20、50、100umol/l不同浓度,根据待测样品浓度可调整标准品浓度;

(5)上样:将标准品液与待测样品液50ul/孔加入,再100ul/孔加入过氧化氢检测液,室温放置30min,于酶标仪560nm波长处检测;

(6)计算:根据标准曲线计算出过氧化氢浓度;

(7)BCA法测定每个样品蛋白浓度,计算出每个样品用蛋白标化后的过氧化氢含量。

1.2.9ROS检测

(1)HepG2细胞接种于24孔板,转染后按细胞分组予不同处理24h后,吸去细胞培养基,每孔加入1mlPBS洗涤2次;

(2)每孔中加入500ul预热到37℃的DCFH-DA稀释液(DCFH-DA原液:无血清DMEM高糖培养基=1:1000),置于细胞培养箱中孵育20min;

(3)每孔中加入500ul预热到37℃的无血清DMEM高糖培养基洗涤3次,以除去未结合的DCFH-FA;

(4)将荧光酶标仪参数设置为激发波长488nm,发射波长525nm并读取荧光值。计算各组ROS的含量;

(5)BCA法测定各组细胞的蛋白浓度,计算ROS含量与总蛋白量的比值,求出各组ROS的相对含量。

                                                   实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)