关键词:TGF-β1    肾小管上皮细胞    科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen   肖特   SCHOTT

 

1.2实验方法

1.2.1人肾小管上皮细胞的培养

(1)HK-2细胞的复苏:将HK-2细胞的冻存管自液氮罐中取出后,用镊子夹住头端,迅速放于37℃水浴箱中,不断轻微晃动使其快速融化。消毒酒精擦拭冻存管后,随即用灭菌玻璃吸管将细胞悬液吸入15ml含有4ml生长培养基的离心管中,水平离心机1000rpm室温离心5min。将上清弃去,加入适量细胞培养基(4ml),轻轻吹打重悬细胞后接种至一次性细胞培养瓶(50ml)中,置于细胞孵育箱(孵育条件37℃,5%CO2)中。

(2)HK-2细胞的传代:正常HK-2细胞用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养,每天显微镜下观察细胞,约3-4天后细胞爬满培养瓶底部约80%可进行细胞传代。用吸管吸尽培养基,用PBS洗涤细胞2次,弃去PBS,加入0.25%胰酶1ml后镜下观察,见大部分细胞缩成圆形变亮,部分细胞与培养瓶壁分离漂浮变成细胞悬液,此时可轻轻用手拍打培养瓶底部使大部分细胞与培养瓶底壁分离,然后加入2ml生长培养基中和胰酶的消化作用。用灭菌玻璃吸管将悬浮细胞液吸入到离心管中,1000rpm室温离心5min,弃去上清,加入3ml细胞培养基,吹打混匀后按1:3比例传代,分别吸出1ml细胞悬液放入3个一次性细胞培养瓶,每个培养瓶中加入细胞培养基4ml,置于细胞孵育箱(孵育条件37℃,5%CO2)中。

(3)HK-2细胞的冻存:显微镜下细胞呈多片大面积集落状,细胞生长至80%左右融合时进行冻存。配置好细胞冻存液,将要冻存的HK-2细胞培养瓶中培养基吸出,用PBS冲洗细胞2次后弃去PBS,根据培养面积加入适量0.25%胰酶溶液适当消化后加入培养基中和,吹吸离散细胞团,将细胞移入15ml离心管,1000rpm室温离心5min,缓慢弃去上层培养基,按比例加入细胞冻存液,重悬细胞,随即尽快将细胞悬液转入细胞冻存管(1-1.5ml/管)。拧紧管盖,放入梯度冻存盒中后直接放于-80℃冰箱过夜,第2日转移入液氮罐中,并记录相关信息。

1.2.2WesternBlotting检测不同浓度TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞E-cadherin及a-SMA蛋白表达变化

(1)实验分组:1)对照组:无血清培养基饥饿孵育72小时;2)TGF-β1(1ng/ml)处理组:含1ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时;3)TGF-β1(2ng/ml)处理组:含2ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时;4)TGF-β1(5ng/ml)处理组:含5ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时;4)TGF-β1(10ng/ml)处理组:含10ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时。

(2)HK-2细胞的培养及TGF-β1处理:HK-2细胞在37℃,5%CO2细胞孵育箱中培养传代,传至4-6代做相关处理。细胞生长至80%左右融合时,超净台内无菌操作,弃细胞培养瓶内培养基,PBS洗2遍,加入0.25%胰酶消化后加入培养基中和后离心,弃上清后适量培养基重悬细胞。细胞计数后按每孔5×103个接种于6孔板中,观察细胞状态良好后无血清培养基饥饿过夜,灭菌玻璃吸管将培养基吸净,随即用灭菌PBS溶液清洗细胞3后分别加入含0、1、2、5、10的TGF-β1与无血清细胞培养基孵育72小时后提取蛋白。

(3)细胞蛋白的提取:将6孔板取出置于冰上,吸去孔中培养液,以冰PBS洗涤细胞3次。尽量吸尽残余PBS后每孔加入含1%EDTA-free(罗氏蛋白酶抑制剂)和1%phosStop(罗氏磷酸酶抑制剂)的蛋白裂解液60-100μl裂解细胞,细胞刮子刮细胞使其与裂解液充分接触,冰上孵育30分钟,用细胞刮子将将裂解液与细胞刮下,转入1.5ml离心管中,12,000rpm4℃离心15min,收集上清,即为细胞蛋白裂解液。

(4)蛋白浓度测定及变性:步骤同第一部分。

(5)westernblotting:步骤同第一部分。

                                          实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)