Insl6对TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化的抑制作用及机制研究

关键词：TGF-β1    肾小管上皮细胞    科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen   肖特   SCHOTT

1.2实验方法

1.2.1人肾小管上皮细胞的培养

(1)HK-2细胞的复苏：将HK-2细胞的冻存管自液氮罐中取出后，用镊子夹住头端，迅速放于37℃水浴箱中，不断轻微晃动使其快速融化。消毒酒精擦拭冻存管后，随即用灭菌玻璃吸管将细胞悬液吸入15ml含有4ml生长培养基的离心管中，水平离心机1000rpm室温离心5min。将上清弃去，加入适量细胞培养基（4ml），轻轻吹打重悬细胞后接种至一次性细胞培养瓶（50ml）中，置于细胞孵育箱（孵育条件37℃，5％CO2）中。

(2)HK-2细胞的传代：正常HK-2细胞用含10%FBS的DMEM/F12培养基培养，每天显微镜下观察细胞，约3-4天后细胞爬满培养瓶底部约80%可进行细胞传代。用吸管吸尽培养基，用PBS洗涤细胞2次，弃去PBS，加入0.25%胰酶1ml后镜下观察，见大部分细胞缩成圆形变亮，部分细胞与培养瓶壁分离漂浮变成细胞悬液，此时可轻轻用手拍打培养瓶底部使大部分细胞与培养瓶底壁分离，然后加入2ml生长培养基中和胰酶的消化作用。用灭菌玻璃吸管将悬浮细胞液吸入到离心管中，1000rpm室温离心5min，弃去上清，加入3ml细胞培养基，吹打混匀后按1:3比例传代，分别吸出1ml细胞悬液放入3个一次性细胞培养瓶，每个培养瓶中加入细胞培养基4ml，置于细胞孵育箱（孵育条件37℃，5％CO2）中。

(3)HK-2细胞的冻存：显微镜下细胞呈多片大面积集落状，细胞生长至80%左右融合时进行冻存。配置好细胞冻存液，将要冻存的HK-2细胞培养瓶中培养基吸出，用PBS冲洗细胞2次后弃去PBS，根据培养面积加入适量0.25%胰酶溶液适当消化后加入培养基中和，吹吸离散细胞团，将细胞移入15ml离心管,1000rpm室温离心5min，缓慢弃去上层培养基，按比例加入细胞冻存液，重悬细胞，随即尽快将细胞悬液转入细胞冻存管（1-1.5ml/管）。拧紧管盖，放入梯度冻存盒中后直接放于-80℃冰箱过夜，第2日转移入液氮罐中，并记录相关信息。

1.2.2WesternBlotting检测不同浓度TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞E-cadherin及a-SMA蛋白表达变化

(1)实验分组：1）对照组：无血清培养基饥饿孵育72小时；2）TGF-β1(1ng/ml)处理组：含1ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时；3）TGF-β1(2ng/ml)处理组：含2ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时；4）TGF-β1(5ng/ml)处理组：含5ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时；4）TGF-β1(10ng/ml)处理组：含10ng/ml人重组TGF-β1的无血清培养基孵育72小时。

(2)HK-2细胞的培养及TGF-β1处理：HK-2细胞在37℃，5％CO2细胞孵育箱中培养传代，传至4-6代做相关处理。细胞生长至80%左右融合时，超净台内无菌操作，弃细胞培养瓶内培养基，PBS洗2遍，加入0.25%胰酶消化后加入培养基中和后离心，弃上清后适量培养基重悬细胞。细胞计数后按每孔5×103个接种于6孔板中，观察细胞状态良好后无血清培养基饥饿过夜，灭菌玻璃吸管将培养基吸净，随即用灭菌PBS溶液清洗细胞3后分别加入含0、1、2、5、10的TGF-β1与无血清细胞培养基孵育72小时后提取蛋白。

(3)细胞蛋白的提取：将6孔板取出置于冰上，吸去孔中培养液,以冰PBS洗涤细胞3次。尽量吸尽残余PBS后每孔加入含1%EDTA-free(罗氏蛋白酶抑制剂)和1%phosStop(罗氏磷酸酶抑制剂)的蛋白裂解液60-100μl裂解细胞,细胞刮子刮细胞使其与裂解液充分接触，冰上孵育30分钟，用细胞刮子将将裂解液与细胞刮下，转入1.5ml离心管中，12,000rpm4℃离心15min，收集上清，即为细胞蛋白裂解液。

(4)蛋白浓度测定及变性：步骤同第一部分。

(5)westernblotting：步骤同第一部分。

                                          实验所需耗材：