关键词:单侧输尿管梗阻    UUO术    肾脏纤维化   科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen   肖特   SCHOTT 

 

1.2.4小鼠肾脏组织获取

(1)小鼠称重,按每g小鼠100ul4%水合氯醛腹腔注射麻醉,待达到麻醉效果后,将小鼠仰卧固定于操作台上。

(2)碘伏或酒精棉球消毒,充分暴露胸腔腹腔。

(3)暴露心脏,剪开右心耳,将灌注针针尖插入左心室,迅速推注生理盐水。

(4)灌注时观察肾脏色泽转白,停止灌注,取出左侧肾脏,测量肾脏大小,称重后小心剥除肾包膜,去除肾积水后再次测量大小并沉称重。

(5)将肾脏横切为两半,一半甲醛固定后石蜡包埋,用于组织病理学相关检测,另一半迅速于液氮中冻存,第二日移入-80℃冰箱冻存,用于提取蛋白及RNA。

1.2.5HE染色

(1)将切好的石蜡切片脱蜡,100%二甲苯Ⅰ中浸泡10min,100%二甲苯Ⅱ中浸泡10min,然后依次100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、50%乙醇浸泡5min,清水冲洗1-2min后,蒸馏水浸泡5min。

(2)苏木素染液染色5min。

(3)1%盐酸酒精分色,镜下观察至细胞核及胞质清晰,约10s。

(4)清水冲洗30min,然后蒸馏水浸泡5min,0.5%伊红染液染色5min。

(5)依次在蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中浸泡2-5min。

(6)100%二甲苯Ⅱ中浸泡5min,100%二甲苯Ⅰ中浸泡5min。中性树胶封片后风干。

1.2.6Masson染色

(1)切片常规脱蜡,步骤同前。

(2)摇床振荡下,去离子水浸泡3次,每次5min。

(3)Masson复合染色液(试剂A)染色30min。

(4)去离子水中冲去试剂A,滴加磷钼酸(试剂C)染色10min。

(5)甩去磷钼酸,直接滴加苯胺蓝(试剂D)染10min。

(6)甩去苯胺蓝,滴加分化液(试剂B)分化30s。

(7)将切片浸入0.2%冰醋酸中10s提色。

(8)依次在蒸馏水、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中浸泡2-5min。

(9)100%二甲苯Ⅱ中浸泡5min,100%二甲苯Ⅰ中浸泡5min。中性树胶封片后风干。

(10)在200倍视野下随机选取互不重叠的视野10个,使用Image-ProPlus6.0软件计算每个视野中蓝色胶原纤维占整个视野的面积百分比。

1.2.7免疫组织化学检测肾脏组织中E-cadherin、a-SMA、FN及TGF-β1的表达

(1)切片常规脱蜡,步骤同前。

(2)切片用PBS洗3次,每次3min,然后甩干切片,轻轻。

(3)抗原修复时将切片浸于枸橼酸缓冲液(PH6.0)中,电磁炉上高火加热3min,再低火加热15min,然后冷却至室温。

(4)切片浸入3%过氧化氢溶液中孵育10-15min,用于封闭内源性过氧化氢酶。

(5)用PBS洗3次,每次3min,滴加山羊血清的封闭液室温下封闭20min,轻轻甩干多余的液体。

(6)滴加一抗(E-cadherin:1:200;a-SMA1:100;FN1:100;TGF-β1:1:100),放入湿盒内4℃孵育过夜。

(7)第2日将切片取出后,用PBS洗3次,每次3min。

(8)滴加试剂1(PolymerHelper),37℃孵育20min,用PBS洗3次,每次3min。

(9)滴加试剂2(Polyperoxidaseanti-mouse/rabbitIgG),37℃孵育20min,用PBS洗3次,每次3min。

(10)滴加DAB显色液,显微镜下观察,出现特异性染色时,蒸馏水终止反应,一般不超过10min。

(11)切片浸于苏木素染缸中,染色约30s,待细胞核显色清楚后迅速用蒸馏水洗去染液,再用蒸馏水洗一次,细胞核显蓝即可。

(12)将切片置于稀水氨中10s返蓝。

(13)依次在PBS、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中浸泡5min。

(14)100%二甲苯Ⅰ中浸泡5min,100%二甲苯Ⅱ中浸泡5min。中性树胶封片后风干。

(2)肾脏组织总RNA提取:

1)称取适量肾脏组织,放入无酶研钵中,加入少许液氮,充分研磨。

2)加入1mlTrizol至研钵中,移液枪反复吹打至裂解液中无明显沉淀为止。

3)将含组织的裂解液转移入无酶离心管中,冰上放置10min,保证充分裂解。

4)12,000rpm4℃离心5分钟,将上清移小心吸入另一无酶离心管中。

5)冰上静置5min,每管加入氯仿200μl,振荡混匀,冰上静置5分钟。

6)12,000rpm4℃离心15min,将上清移小心吸入另一无酶离心管中

7)加入异丙醇500μl,轻微振荡混匀,冰上静置10min。

8)12,000rpm4℃离心10分钟,观察有无沉淀,无沉淀可重复离心一次,然后小心洗干净上清。

9)加入1ml预冷的75%无水乙醇,轻微摇晃清洗后,7,500rpm4℃离心5min后吸净乙醇。

10)重复上述步骤6)一次,在室温中晾干或者用真空干燥大约5-10min,加入20μlDEPC水,充分溶解。

(3)RNA浓度的测定:打开测量软件,选择测量目标性质,用DEPC水清洗2-3次测量头。在测量位置加2μlDEPC水,点击测量15次预热后调零。用滤纸吸干DEPC水,加入2μl待测RNA样品,点击测量后读取浓度及纯度(A260/A280在1.8-2.0之间则可用),-80℃保存。

1.2.9WesternBlotting检测肾脏组织TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白及其磷酸化表达

(1)组织蛋白的提取:称取适量肾脏组织,放入1.5ml离心管中,按照1ug加入7μl蛋白裂解液计算加入含1%EDTA-free(罗氏蛋白酶抑制剂)和1%phosStop(罗氏磷酸酶抑制剂)的蛋白裂解液,超声波破碎仪冰上裂解组织,500w×30s,振荡器振荡10s,然后冰上孵育30min,12,000rpm4℃离心15分钟,收集上清,即为组织蛋白裂解液。

(2)蛋白浓度测定及变性:将3.0μg/μlBSA即蛋白标准品,用蛋白标准品稀释液配制成0.5μg/μl,分装后-80℃保存备用。将96孔板标准曲线及待测蛋白位置做好标记,按标准曲线浓度梯度分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的0.5μg/μl蛋白标准品稀释液,待测蛋白每孔2μl,各组用PBS补平20μl体积,将BCA试剂A液、B液按照50:1体积根据实际实验量需要配制显色液,每个孔加入200μl配好的显色液,混匀,37℃孵育30分钟,用酶标仪测595nm处吸光度值。将吸光度值与标准蛋白稀释品浓度用计算机软件做标准曲线,根据标准曲线公式计算各样品的蛋白浓度。根据计算结果用裂解缓冲液将各组样品蛋白浓度调为一致。样本蛋白与5xSDS样品缓冲液混匀按照4:1比例配制混匀后,95℃煮沸5min变性后-20℃保存备用。

(3)westernblotting

1)根据蛋白分子量大小按照SDS-PAGE凝胶试剂盒说明书灌制不同浓度分离胶和5%的浓缩胶。

2)根据实验要求用微量进样器将样品依次加到样品槽中,保证每个样品槽中蛋白总量相同。

3)将电泳槽内外加上电泳液,连接好稳压直流电源的正负极。起始电压80V,待溴酚蓝条带进入分离胶后调电压至120V。恒压状态下继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部停止电泳。

4)电泳结束前,剪好适当形状的PVDF膜并进行标记(注意必须带手套,不要用手直接接触膜),将PVDF膜用甲醇极化。根据蛋白Marker切胶,放入转膜缓冲液中,也PVDF膜与棉垫、滤纸一起放入转膜缓冲液中,从黑色板向上按照棉垫-滤纸-胶-膜-滤纸-棉垫的顺序放入,夹紧凝胶夹,放入转移槽中,黑色板对准阴极。加入转移缓冲液,250mA恒定电流,转移时间根据蛋白分子量大小决定。

5)转膜结束后,用1×PBST洗膜5分钟,然后将PVDF膜浸入5%脱脂奶粉中,在摇床上慢摇2小时封闭。

6)将封闭好的PVDF膜用TBST室温下洗涤5分钟。参考抗体说明书比例稀释一抗(a-SMA:1:200;E-cadherin:1:1000;GAPDH:l:1000),将相对应的PVDF分别与不同抗体孵育,4℃过夜。

7)第2日将PVDF膜取出TBST洗膜,15min/次,洗3次后,以1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗分别与PVDF膜在37℃条件下孵育1小时。

8)将PVDF膜取出后1xPBST洗膜10分钟,3次。

9)洗膜结束后,将膜上PBST用干净滤纸轻轻吸干,加入显色液,在凝胶成像系统上进行显影。

10)将采集显影后的条带图片,用凝胶成像系统软件进行半定量分析,以目的蛋白与GAPDH条带平均荧光强度比值表示目的蛋白的相对表达。

 

                                                   实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)