沉默Id1基因对骨肉瘤细胞K7M2-WT增殖、迁移及凋亡的影响

关键词：Id1基因    骨肉瘤细胞    科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen    肖特   SCHOTT

2.2重组腺病毒的制备

(1).将HEK-293细胞传代至大培养瓶中，传代后6~8小时，此时细胞处于对数生长期，为重组腺病毒感染的最佳时刻；

(2).加入1ml含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基在无菌1.5mlEP管，再取1µl重组腺病毒加入EP管中，吹打至均匀；

(3).将EP管中液体小心移至培养瓶中，轻轻上下左右摇晃3次，置于37℃、5%CO2培养箱中培养；(4).加入重组腺病毒24h后在荧光显微镜下观察细胞RFP表达情况。

(5).腺病毒感染后4～5d，待细胞漂浮50～60%左右，此时为收集最佳时期；

(6).轻轻吹打培养瓶底细胞至悬浮细胞，收集HEK-293细胞悬液至50ml离心管中。1000rmp，离心5min，弃上清液，收集沉淀；

(7).加入1ml新鲜培养基，震荡至混匀，放入-80℃冰箱，过夜后，37℃水浴融解，反复冻融三次；

(8).1200rmp，离心5min，收集上清液，扩增腺病毒存在于上清液中；

(9).分装后，-80℃保存备用。

2.3病毒最适感染量测定

(1).将小鼠骨肉瘤细胞K7M2-KW用含有10%FBS的DMEM培养基的接种于24孔板中，1×105个/孔；

(2).接种6～8h后，细胞已贴壁，按稀释比例加入重组腺病毒，每孔设置3个复孔；

(3).将细胞置于37℃、5%的CO2的培养箱中培养，每隔24h观察细胞RFP的表达情况；

(4).根据细胞荧光表达情况及细胞生长状态，确定重组腺病毒最适感染量。

2.7MTT法检测AdsimId1对K7M2-WT细胞增殖的影响

(1).取对数生长期细胞按2×106/孔接种于60mm培养皿中，待细胞贴壁后分别加入最适浓度的AdsiRNA及AdsimId1重组腺病毒；

(2).加入病毒3d后，0.25%的胰蛋白消化酶消化细胞成单悬浮细胞，细胞计数1×105个/ml，接种于96孔板中200µl每孔，设置3个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养，分别在1、2、3、4、5d检测细胞增殖情况；

(3).弃培养基，PBS洗涤2遍，加入180µl10%FBS新鲜培养基，20µl5mg/mlMTT液，培养箱中继续孵育4h；

(4).吸去培养基，加入150µlDMSO，将96孔板避光置于摇床上机震荡10min，使结晶物充分溶解；

(5).在全自动定量酶标仪490nm波长下测定每孔OD值；

(6).计算各平行孔OD值，计算相对抑制率(%)＝[(对照组OD均值－本底值)－(实验组OD均值－本底值)/(对照组OD均值－本底值)]×100%。实验重复3次；

(7).分析结果，绘制生长曲线；

2.8划痕实验检测细胞迁移

(1).将取对数生长期K7M2-WT细胞接种于6孔板中(1×106/孔)，待细胞贴壁后，分别加入适量的重组腺病毒感染；

(2).加入重组腺病毒感染3d后，用10µltip头垂直贴壁划痕；

(3).用PBS洗去划下的细胞，分别加入5ml无血清培养基，放入37℃，5%CO2的培养箱中培养；

(4).每隔24h在显微镜下观察细胞迁移情况，并拍照记录。

2.9Transwell小室实验检测细胞迁移

(1).细胞准备：对数生长期K7M2-WT细胞接种60mm培养皿，分别加入适量腺病毒感染3d，分组同前；

(2).消化离心后收集细胞，加入无血清DMEM完全培养基悬浮，细胞计数调整细胞浓度为1×104/ml；

(3).在下室加入含10%FBS的新鲜DMEM培养基600µl，取200µl细胞悬液加入Transwell上室中。

(4).在培养箱中37℃、5%CO2培养24h后，取出小室，用棉签擦去上室中的细胞，PBS洗涤3遍，4%多聚甲醛固定20min，1μg/mlDAPI染色5min，PBS洗涤3遍，在荧光显微镜100倍下计数10个非重复视野，计算平均数，试验重复3次。

2.10DAPI核染法检测细胞凋亡

(1).取对数生长期K7M2-WT细胞按1×105/孔接种于24孔板中；

(2).分组同前，分别加入最适感染量重组腺病毒感染3d，弃上清液，PBS洗涤遍；

(3).4%多聚甲醛室温下固定20min，每孔3ml1μg/mlDAPI染色5min，PBS洗涤3遍，荧光显微镜下观察并拍照。实验重复3遍。

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1.2FlexiGeneDNAKit试剂盒DNA提取具体步骤

（1）DNA提取之前的注意事项：z用1.4mlBufferFG3重新混悬QIAGENProtease，然后存储在2-8℃或者等分后放置在-20℃冰箱中待用。z冷冻的血样应该用37℃的水浴中轻轻振荡快速地溶解，然后放置在冰盒中待用。z计算所提取血样的总体积，1ml血样×（500ulBufferFG2×5ul混悬QIAGENProtease），注意：BufferFG2/QIAGENProtease混合溶液在使用之前不超过1小时。z第5步和第13步所使用的水浴温度为65℃。

（2）DNA提取步骤

z吸取5.0ml的BufferFG1至15ml的离心管。加2ml的全血，上下颠倒离心管5次。

z2000转离心5分钟

z弃去上清液，倒置在铺有吸水纸的桌上2分钟，离心管底部的团块不要流出。

注意：有少部分案例中，离心管底部的团块比较疏松，容易流出，所以要轻倒上清液，倒置的过程中尽量减少上清液的反流。

z加1ml的BufferFG2/QIAGENProtease，盖上离心管，立即涡旋，直到团块溶解分布均匀。注意：在同时处理多个样本时，每一个样本在加完BufferFG2/QIAGENProtease后，都要立即涡旋，不要等到所有样本的Buffer都加完才去涡旋。一般情况下，高速涡旋5s，团块就可以分解，如果仍然可以看到有团块没有分解，再加300ulBufferFG2，再次涡旋，直到团块全部溶解。

z上下颠倒离心管3次，65℃水浴10分钟。注意：溶液从红色变为草绿色表示蛋白正在被溶解。

z加1ml的异丙醇（100%），反复颠倒离心管，使溶液充分混合，直到可以看到螺纹状或是团块状的DNA沉淀析出。注意：一定要使异丙醇与溶液充分混合，如果看不到DNA析出，应上下颠倒离心管至少20次。

z2000转离心3分钟。注意：如果DNA团块比较疏松，应延长离心时间，用更高的转速离心。

z轻倒上清液，将离心管倒置在吸水纸上，注意不要将离心管底部的团块倒出。

注意：有些团块比较疏松，所以尽量轻倒，如果血样中的白细胞数量足够多，这时候应该可以看到白色的DNA团块聚集在离心管的底部。

z加1ml70%的乙醇，涡旋5秒钟。

z2000转离心3分钟。注意：假如块状物是松动的，应延长离心时间或使用更高的转速。

z轻倒上清液，将离心管倒置在吸水纸上至少5分钟，注意不要将管底的块状物

倒出。注意：在极少的案例中，块状物比较疏松，所以尽量要轻倒上清液，在倒置离心管的过程中，尽量减少乙醇的返流。

z将DNA块状物在空气中挥干(至少5分钟），确保管中无液体存在。注意：也不要过分挥干，如果过度挥干的话，DNA再溶解会比较困难。

z加200ul的BufferFG3，低速涡旋5秒钟，然后65℃水浴孵育1小时。注意：如果DNA没有完全溶解，将溶液在室温下过夜。

z将DNA溶解液转移至1.5ml的EP管中，-20℃保存，临用前解冻。

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                                                 实验所需耗材：