关键词:Id1基因    骨肉瘤细胞    科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen    肖特   SCHOTT

 

2.2重组腺病毒的制备

(1).将HEK-293细胞传代至大培养瓶中,传代后6~8小时,此时细胞处于对数生长期,为重组腺病毒感染的最佳时刻;

(2).加入1ml含有10%胎牛血清的新鲜DMEM培养基在无菌1.5mlEP管,再取1µl重组腺病毒加入EP管中,吹打至均匀;

(3).将EP管中液体小心移至培养瓶中,轻轻上下左右摇晃3次,置于37℃、5%CO2培养箱中培养;(4).加入重组腺病毒24h后在荧光显微镜下观察细胞RFP表达情况。

(5).腺病毒感染后4~5d,待细胞漂浮50~60%左右,此时为收集最佳时期;

(6).轻轻吹打培养瓶底细胞至悬浮细胞,收集HEK-293细胞悬液至50ml离心管中。1000rmp,离心5min,弃上清液,收集沉淀;

(7).加入1ml新鲜培养基,震荡至混匀,放入-80℃冰箱,过夜后,37℃水浴融解,反复冻融三次;

(8).1200rmp,离心5min,收集上清液,扩增腺病毒存在于上清液中;

(9).分装后,-80℃保存备用。

2.3病毒最适感染量测定

(1).将小鼠骨肉瘤细胞K7M2-KW用含有10%FBS的DMEM培养基的接种于24孔板中,1×105个/孔;

(2).接种6~8h后,细胞已贴壁,按稀释比例加入重组腺病毒,每孔设置3个复孔;

(3).将细胞置于37℃、5%的CO2的培养箱中培养,每隔24h观察细胞RFP的表达情况;

(4).根据细胞荧光表达情况及细胞生长状态,确定重组腺病毒最适感染量。

2.7MTT法检测AdsimId1对K7M2-WT细胞增殖的影响

(1).取对数生长期细胞按2×106/孔接种于60mm培养皿中,待细胞贴壁后分别加入最适浓度的AdsiRNA及AdsimId1重组腺病毒;

(2).加入病毒3d后,0.25%的胰蛋白消化酶消化细胞成单悬浮细胞,细胞计数1×105个/ml,接种于96孔板中200µl每孔,设置3个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养,分别在1、2、3、4、5d检测细胞增殖情况;

(3).弃培养基,PBS洗涤2遍,加入180µl10%FBS新鲜培养基,20µl5mg/mlMTT液,培养箱中继续孵育4h;

(4).吸去培养基,加入150µlDMSO,将96孔板避光置于摇床上机震荡10min,使结晶物充分溶解;

(5).在全自动定量酶标仪490nm波长下测定每孔OD值;

(6).计算各平行孔OD值,计算相对抑制率(%)=[(对照组OD均值-本底值)-(实验组OD均值-本底值)/(对照组OD均值-本底值)]×100%。实验重复3次;

(7).分析结果,绘制生长曲线;

2.8划痕实验检测细胞迁移

(1).将取对数生长期K7M2-WT细胞接种于6孔板中(1×106/孔),待细胞贴壁后,分别加入适量的重组腺病毒感染;

(2).加入重组腺病毒感染3d后,用10µltip头垂直贴壁划痕;

(3).用PBS洗去划下的细胞,分别加入5ml无血清培养基,放入37℃,5%CO2的培养箱中培养;

(4).每隔24h在显微镜下观察细胞迁移情况,并拍照记录。

2.9Transwell小室实验检测细胞迁移

(1).细胞准备:对数生长期K7M2-WT细胞接种60mm培养皿,分别加入适量腺病毒感染3d,分组同前;

(2).消化离心后收集细胞,加入无血清DMEM完全培养基悬浮,细胞计数调整细胞浓度为1×104/ml;

(3).在下室加入含10%FBS的新鲜DMEM培养基600µl,取200µl细胞悬液加入Transwell上室中。

(4).在培养箱中37℃、5%CO2培养24h后,取出小室,用棉签擦去上室中的细胞,PBS洗涤3遍,4%多聚甲醛固定20min,1μg/mlDAPI染色5min,PBS洗涤3遍,在荧光显微镜100倍下计数10个非重复视野,计算平均数,试验重复3次。

2.10DAPI核染法检测细胞凋亡

(1).取对数生长期K7M2-WT细胞按1×105/孔接种于24孔板中;

(2).分组同前,分别加入最适感染量重组腺病毒感染3d,弃上清液,PBS洗涤遍;

(3).4%多聚甲醛室温下固定20min,每孔3ml1μg/mlDAPI染色5min,PBS洗涤3遍,荧光显微镜下观察并拍照。实验重复3遍。

GSTP1,ERCC1,MTHFR基因多态性与晚期结直肠癌患者FOLFOX方案化疗疗效的相关性研究

1.2FlexiGeneDNAKit试剂盒DNA提取具体步骤

(1)DNA提取之前的注意事项:z用1.4mlBufferFG3重新混悬QIAGENProtease,然后存储在2-8℃或者等分后放置在-20℃冰箱中待用。z冷冻的血样应该用37℃的水浴中轻轻振荡快速地溶解,然后放置在冰盒中待用。z计算所提取血样的总体积,1ml血样×(500ulBufferFG2×5ul混悬QIAGENProtease),注意:BufferFG2/QIAGENProtease混合溶液在使用之前不超过1小时。z第5步和第13步所使用的水浴温度为65℃。

(2)DNA提取步骤

z吸取5.0ml的BufferFG1至15ml的离心管。加2ml的全血,上下颠倒离心管5次。

z2000转离心5分钟

z弃去上清液,倒置在铺有吸水纸的桌上2分钟,离心管底部的团块不要流出。

注意:有少部分案例中,离心管底部的团块比较疏松,容易流出,所以要轻倒上清液,倒置的过程中尽量减少上清液的反流。

z加1ml的BufferFG2/QIAGENProtease,盖上离心管,立即涡旋,直到团块溶解分布均匀。注意:在同时处理多个样本时,每一个样本在加完BufferFG2/QIAGENProtease后,都要立即涡旋,不要等到所有样本的Buffer都加完才去涡旋。一般情况下,高速涡旋5s,团块就可以分解,如果仍然可以看到有团块没有分解,再加300ulBufferFG2,再次涡旋,直到团块全部溶解。

z上下颠倒离心管3次,65℃水浴10分钟。注意:溶液从红色变为草绿色表示蛋白正在被溶解。

z加1ml的异丙醇(100%),反复颠倒离心管,使溶液充分混合,直到可以看到螺纹状或是团块状的DNA沉淀析出。注意:一定要使异丙醇与溶液充分混合,如果看不到DNA析出,应上下颠倒离心管至少20次。

z2000转离心3分钟。注意:如果DNA团块比较疏松,应延长离心时间,用更高的转速离心。

z轻倒上清液,将离心管倒置在吸水纸上,注意不要将离心管底部的团块倒出。

注意:有些团块比较疏松,所以尽量轻倒,如果血样中的白细胞数量足够多,这时候应该可以看到白色的DNA团块聚集在离心管的底部。

z加1ml70%的乙醇,涡旋5秒钟。

z2000转离心3分钟。注意:假如块状物是松动的,应延长离心时间或使用更高的转速。

z轻倒上清液,将离心管倒置在吸水纸上至少5分钟,注意不要将管底的块状物

倒出。注意:在极少的案例中,块状物比较疏松,所以尽量要轻倒上清液,在倒置离心管的过程中,尽量减少乙醇的返流。

z将DNA块状物在空气中挥干(至少5分钟),确保管中无液体存在。注意:也不要过分挥干,如果过度挥干的话,DNA再溶解会比较困难。

z加200ul的BufferFG3,低速涡旋5秒钟,然后65℃水浴孵育1小时。注意:如果DNA没有完全溶解,将溶液在室温下过夜。

z将DNA溶解液转移至1.5ml的EP管中,-20℃保存,临用前解冻。

Insl6通过调控TGF-β/Smad信号通路抑制肾脏纤维化

 

                                                 实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)