关键词:Id1基因    C3H10    MC3T3-E1细胞    科进   Kirgen   卧宏生物   WHB   爱思进   Axygen   科晶   Cystalgen    肖特   SCHOTT

 

2.1细胞复苏及培养

(1).打开恒温水浴箱,待水温度至37℃;

(2).从液氮罐中取出C3H10、MC3T3-E1、K7M2-WT细胞冻存管后,迅速放于37℃恒温水浴箱中,为使冻存液短时间解冻,轻轻不断摇晃冻存管;

(3).将解冻的细胞悬液加入10倍DMEM中,轻轻吹打混匀后离心1000rmp5min,弃上清液,5ml含10%FBSDMEM培养基重悬细胞,转入T25培养瓶中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养;

(4).根据细胞生长情况2~3d更换培养基,待细胞铺满瓶底80~90%做传代培养;

(5).弃培养基,PBS洗2遍,0.25%胰蛋白酶消化2~5min,10%胎牛血清DMEM培养基5ml重悬细胞,按1:2~3传代。

2.2RT-PCR检测

2.2.1细胞处理

复苏C3H10、MC3T3-E1、K7M2-WT细胞接种25T培养瓶,待细胞生长密度达80~90%,取生长状态良好的细胞提取RNA,检测Id1表达情况。

2.2.2Trizol法提取细胞总RNA步骤:

(1).细胞裂解:细胞弃上清,PBS洗涤两遍,直接加入Trizol裂解细胞,每25T培养瓶(约2×106个细胞)加入1mlTrizol;

(2).分层:加入Trizol后,为使样本充分裂解,在冰上放置3~5min。收集裂解液后转入1.5mlEP管中,每1ml裂解液中加入360µl氯仿,剧烈充分摇晃混匀(注意不能涡旋震荡)后冰上放置5min,使其自然分相;

(3).沉淀RNA:将离心管放入事先预冷的4℃离心机离心,14,000rpm15min,取出用移液器小心吸取吸取上层无色水相约550µl加入新的无酶EP管中;勿吸到中间层和下层红色有机相,导致RNA污染;

(4).在EP管中加入700µl异丙醇(提前4℃预冷),上下颠倒混匀后,4℃离心机12,000rmp离心12min,倾倒上清液,EP管管底可见白色沉淀物即RNA;

(5).漂洗RNA:加入1mlRNase-free水配置的75%乙醇(提前4℃预冷)于RNA沉淀中,剧烈震荡离心管,使沉淀悬浮。4℃离心机离心12,000rmp5min,弃上清,短暂快速离心后,移液器吸出残留液体,室温下放置1~2min晾干;

(6).溶解RNA:加入20µlRNase-free水溶解RNA沉淀。若不及时逆转录可放-80℃保存备用。

2.3蛋白质印迹法检测Id1的表达

2.3.1真核细胞裂解法提取细胞总蛋白

(1).将C3H10、MC3T3-E1、K7M2-WT细胞分别接种6孔板中,待细胞生长铺满80%左右,取生长状态良好的细胞提取总蛋白,检测Id1蛋白水平表达情况;

(2).取出细胞,弃培养基,PBS轻轻洗涤2遍,吸干残余PBS,每孔加入200µl真核细胞裂解液,冰上裂解30min,4℃离心机离心12,000rmp15min,收集上清液。BCA测蛋白浓度(见2.4.2),裂解液调整蛋白浓度至一致,按体积比4:1加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,沸水下煮20min,分装放﹣80℃冰箱备用。

2.3.2BCA法测蛋白浓度

(1).配置AB混合液A:B=50:1配置,96孔板每孔加入100µl;

(2).分别按照碧云天BCA蛋白浓度测量试剂盒说明书加入标准蛋白及待测样本组分,设置2个复孔;

(3).加完后,在75℃烤箱反应20min,取出在全自动酶标仪下(562nm波长)读数;

(4).计算出标准曲线方程,用待测样本OD值求出待测样本蛋白浓度。

 

                                               实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)