关键词:2/15-LOX    糖尿病    大鼠脑损伤    认知功能障碍    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

1.2.5大鼠海马及皮层组织病理学观察

对大鼠进行腹腔取血后,每组各随机选取3只大鼠,剪开腹腔和胸腔,在腹腔开口处用眼科剪剪开肝脏约1-2cm作为血液与灌注液的出口,打开胸腔后分离左心室,保持灌注针进入左心室尖1cm处并固定在位,先后经左心室快速注入生理盐水约100ml,再从进针处推注4%多聚甲醛约100-150ml进行在体脑组织固定,推注4%多聚甲醛直至肝脏处发白后,立即快速分离出完整脑组织并浸泡于4%多聚甲醛中固定24h。进行乙醇梯度脱水后对脑组织进行石蜡包埋后进行冠状切片为4μm的石蜡切片,并对选择连续多个石蜡切片进行苏木素伊红染色(Hematoxylin-eosinStaining,HE),观察大鼠海马及皮层神经元结构形态变化。

1.2.6大鼠海马及皮层12/15-LOX、p38MAPK、Phospho-p38MAPK、caspase-3、caspase-9、BCL-2、Aβ1-42及cPLA2蛋白表达测定

 

1.2.6.110%大鼠海马及皮层组织总蛋白的提取

(1)组织蛋白提取:

在大鼠腹腔取血后,分别在每组各取5只大鼠,快速断头处死,在冰面上快速分离出海马及皮层组织进行分装,分别装入1.5mlEP管中,做好标记并封口后冻于液氮中,后转入-80Cº超低温冰箱中保存,经常使用时可以保存于-20℃冰箱中。根据碧云天蛋白提取试剂盒的操作要求,进行总蛋白提取之前先进行蛋白裂解液的配制,在1mlRIPA中加入10μlPMSF(100mM)以及2μl磷酸酶抑制剂配置裂解液。提取各组蛋白时将EP管从冰箱中取出,取少许进行精密称重后按质量体积比1:9加入蛋白裂解液,在冰面上采用玻璃匀浆器中充分匀浆,于4Cº下,12000rpm/min离心10min后留取上清液。取适量样品用于蛋白定量,剩下部分按照4:1(V/V)的体积比例加入5×loadingbuffer蛋白上样缓冲液,充分混匀后在沸水中煮沸10-15min使蛋白充分变性,冷却并放置至室温后转入-20Cº保存待用。

(2)组织蛋白含量测定

采用碧云天BCA试剂盒进行组织蛋白含量测定,BCA试剂A与试剂B按照50:1(V:V)的比例充分混匀后制成工作液。测定的具体方法如下:取10%大鼠海马及皮层匀浆20μl,加入PBS使其总体积为2ml,按照BCA法进行总蛋白含量测定,操作在96孔板中进行,每个样品与蛋白标准品做3个复孔。

 

1.2.6.2Westernblotting检测操作步骤

(1)灌胶与上样

准备清洗干净并风干的电泳玻璃板,根据六一DN60电泳槽的安装要求,先安装蛋白垂直电泳槽,将凹槽板置于内侧,普通板置于外侧叠加放置在电泳槽中,夹紧玻璃板后用注射器吸取无水乙醇并注入两块玻璃板中间,静置5-10min后检查电泳玻璃板槽安装后的密封度,是否完全密封。根据碧云天SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书,依次配制12%的下层分离胶和5%的上层浓缩胶。取出-20℃保存的蛋白样品,置于4℃低温中缓慢解冻,解冻并混匀后,根据上样顺序依次加入到各上样孔中,保持各孔上样蛋白总量相等,并在其中上样孔中加入彩虹180广谱蛋白marker。

(2)电泳

加样后,在电泳槽中缓慢注入SDS缓冲电泳液,注意不要冲到上样的蛋白,并将电泳槽连接电源进行电泳。采用先稳压后稳流的方式进行:先恒压90V,约30min后并观察蛋白上样缓冲液中的溴酚蓝染料电泳自浓缩胶转入分离胶后,改为恒压120V,继续电泳约1.5h后至蛋白上样缓冲液中的溴酚蓝染料到达下层分离胶底部,但不可跑出分离胶,即可终止电泳进行转膜。

(3)切胶及转膜

关闭电泳槽电源,从电泳槽中取出凝胶,保持凝胶湿润并根据彩虹180广谱蛋白marker说明书指示的蛋白将目的蛋白处的条带切下需要的凝胶,于1×转移缓冲液中平衡10min。将与凝胶大小相近的预先裁剪并做好标记的0.45μmPVDF膜置于甲醇中浸泡1-2min充分激活后放入转膜液中漂洗,当PVDF膜被充分激活后在转膜液中会浮于液体表面并左右旋转。并根据彩虹180广谱蛋白marker指示切下的凝胶条带及激活后的PVDF膜按照“海绵-滤纸-凝胶-PDVF膜-滤纸-海绵”三明治组合的方式组装转膜板,PVDF膜靠正极侧,凝胶靠负极,将转膜槽放冰浴中,以220A恒定电流转膜,按照1KD蛋白分子转膜1min设定转膜时间。

(4)封闭

当转膜时间结束后,从转膜槽中取出PVDF膜,小心保持PVDF膜湿润,将蛋白面向上放置于含5%BSA的蛋白孵育盒中(预先采用BSA粉溶于TBST中),在室温下置于摇床上缓慢摇动2h,确保PVDF膜能够完全被封闭液浸泡。

(5)孵育抗体

取出PVDF膜,根据预染蛋白Marker标记并切胶转膜后的PVDF膜分别加入到含有不同一抗的蛋白孵育盒中,12/15-LOX一抗(1:500),p38MAPK一抗(1:500),caspase-3,caspase-9一抗(1:1000),Bcl-2一抗(1:2000),Aβ1-42(1:500),cPLA2

一抗(1:500)及Phospho-p38MAPK一抗(1:500)在4℃下置于摇床上缓慢摇动过夜。

(6)洗膜并孵育二抗

过夜后取出蛋白孵育盒,室温下置于摇床上复温30min,取出PVDF膜,回收一抗。在蛋白孵育盒中加入TBST,置于摇床上快速摇动10min,重复三次。洗膜后取出PVDF膜,β-actin一抗孵育的膜用生物素标记的羊抗小鼠二抗(1:6000,TBST)孵育,其余的膜用HRP标记的羊抗小鼠和羊抗兔二抗(1:4000,TBST)室温下摇床缓慢摇动孵育2h。

(7)洗膜并孵育三抗

取出PVDF膜,回收一抗。在蛋白孵育盒中加入TBST,置于摇床上快速摇动10min,重复三次。洗膜后取出PVDF膜,β-actin一抗孵育的膜于TBST中放置于4℃下,其余的膜用链和亲和素标记的三抗(1:8000,TBST)室温摇床下缓慢摇动孵育1h。

(8)显影

取出剩余的PVDF膜,TBST中洗膜三次,每次10min;采用预先配置好的ECLplus试剂显色,配置方法为ECL试剂盒中的A试剂:B试剂(V:V)=1:1,配置时注意避光和冷藏,使用BioRad凝胶成像系统显影,根据条带曝光情况选择合适的曝光时间及曝光图像数量,检测目的蛋白条带和β-actin条带的体积,以目的条带与β-actin条带体积比表示目的蛋白的表达水平。

 

                                                实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)