关键词:PRDX2    基因表达    结肠癌干细胞    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

2.3慢病毒转染结肠癌细胞SW620、HT29、HCT116建立稳定细胞株

2.3.1转染预实验

按照上海吉凯基因化学技术有限公司提供的说明书,使用阴性对照病毒(LV-Cont)确定三种细胞的最佳转染条件。阴性对照病毒以MOI值为10,20,40,60,80,100转染SW620、HT29、HCT116。添加剂polybrene终浓度为5μg/ml,感染增强剂ENI.S用量为转染时培养液总量的一半,MOI=每组所用病毒颗粒数/对应细胞数。大致步骤如下:1)取对数生长期的结肠癌细胞SW620、HT29、HCT116,以5×103个细胞/孔接种在96孔板上;

2)常规培养24小时,弃各孔培养基,按照上述条件加入适量的培养液、ploybrene、ENI.S及阴性对照病毒;

3)12小时后更换孔内培养液为新鲜完全培养基;

4)转染72小时后在倒置荧光显微镜下观察细胞的转染情况以确定最佳转染条件。

2.3.2嘌呤霉素筛选浓度的确定

1)取对数生长期的结肠癌细胞以50%密度接种到6孔板,新鲜完全培养基孵育24小时;

2)在6孔板培养基中按1,2,3,4,5,6μg/ml的浓度加入嘌呤霉素,每2天更换一次培养基,嘌呤霉素浓度维持不变;

3)每天观察,取4天内细胞全部死亡的浓度为筛选浓度。

2.3.3慢病毒转染结肠癌细胞SW620、HT29、HCT116建立PRDX2敲减及过表达细胞株

1)取对数期生长的SW620、HT29、HCT116细胞,按每孔5×104个细胞接种于6孔板;

2)常规培养24小时,弃培养基,按照预实验确定的最佳转染条件进行转染;

3)12小时候更换培养基为新鲜完全培养基;

4)转染72小时后在倒置荧光显微镜下观察细胞转染情况;

5)用嘌呤霉素筛选转染细胞;

6)稳定的转染细胞转移至培养瓶中继续培养。

 

2.3.5.1细胞总RNA的提取

1)在超净台操作,弃培养液,PBS漂洗2次,尽量吸尽残余PBS。每瓶加1mlRNAisoPlus。摇晃3-5次,吹打40次,移至1.5mlEP管,分别编号。

2)各管中加入0.2ml氯仿,振荡15秒,待管内液体充分乳化为后,冰上静置3分钟。

3)4℃离心15分钟,12000rpm。

4)小心吸取上清约500μl于新EP管中,各管编号。

5)加入0.5ml异丙醇(与吸出的上清液等体积),振荡混匀,冰上静置10分钟。

6)4℃离心10分钟,12000rpm。

7)弃上清,沿管壁缓慢加入无水乙醇0.75ml和RNase-free水0.25ml,充分振荡。

8)4℃离心5分钟,12000rpm。

9)弃乙醇,室温干燥5分钟,加入0.1mlRNase-free水溶解沉淀。

注意事项:所有EP管、枪头和相关溶液都必须无RNA酶污染。

 

2.3.5.2RNA浓度与纯度测定

1)RNA纯度测定:用紫外分光光度计测定OD260nm和OD280nm,用OD260nm/OD280nm比值衡量,若比值在1.8-2.0之间,则符合RNA样品要求。

2)RNA浓度测定:用紫外分光光度计直接测定RNA浓度。

2.3.5.3琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

1)制胶:称取0.7g琼脂糖溶于100ml1×TAE缓冲液中,加热至沸腾,冷却至60℃后加入核酸染料,摇匀,灌制到组装好的凝胶板;待胶凝后拔下梳子,将胶板放入电泳槽中,加1×TAE缓冲液至没过胶面。

2)电泳:取1.5µlRNA样本与4.5µl1×loadingbuffer混匀,上样于胶孔,恒压100V10min。

3)观察:紫外透射光下观察并拍照。28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓。还可能观察到一个更小稍微扩散的带,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖体RNA)组成。在18S和28S核糖体带之间一般可以看到一片弥散的核酸染色物质,可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染,将会在28S核糖体RNA带的上面出现,即更高分子量的弥散迁移物质或者带。RA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。

 

2.4.3细胞成球实验

1)取对数期贴壁细胞消化,终止消化,细胞计数板计数;

2)超低粘附6孔板中每孔1000个细胞和1ml无血清培养基,观察7-10天;

(注:细胞密度很关键,因为太多细胞会聚集造成假阳性,太少则无法成球,推荐多密度尝试,务必使细胞成为单细胞悬液)

3)每隔3天每孔加50-100μl无血清培养基,动作轻柔以免球体分散;

4)7-10天后观察球体并采图,用imageproplus6.0分析图像计数球体。

 

2.4.4干细胞对5-FU敏感性检测

1)取对数生长期细胞消化,终止消化,用免疫磁珠分离CD133+细胞,计数后分离出相同数量的细胞在无血清培养基中继续培养;

2)用不同浓度5-FU进行干预48h;

3)收集细胞,消化成单细胞悬液,无血清培养基重悬后送检流式细胞仪检测细胞凋亡情况;

4)分析早期凋亡和晚期凋亡数据。

2.4.5克隆细胞存活实验

1)取对数生长期细胞消化,终止消化,细胞计数;

2)分离1×105个细胞在24孔板中用完全培养基培养;

3)待细胞贴壁后加入不同浓度的5-FU药物干预8天;

4)去掉孔板内培养基,PBS漂洗三次,用甲醇固定10min,0.5%结晶紫溶液染色10min,用PBS漂洗三次,晾干后即可采集图像;

5)用甲醇再次溶解孔板内的结晶紫,分光光度计540nm测量孔板内液体的吸光度值,绘制曲线。

 

2.4.6荷瘤裸鼠模型的建立

1)培养HCT116细胞至对数生长期,胰酶消化成单细胞悬液,免疫磁珠法分离出CD133+细胞,细胞在无血清培养及中继续培养。

2)在无血清培养及中培养的微球体消化成单细胞悬液,计数后取1×105个细胞制成100ul细胞悬液注射样本,冰上备用。

3)取4周龄BLAB/nu-c雌性裸鼠,在每只裸鼠右侧腋窝皮下注射100ul准备好的细胞悬液,接种后观察肿瘤生长情况。

4)带肿瘤体积达到50mm3以上时,每隔一天用游标卡尺测量瘤体的长度A和宽度B,按照公式V=AB2/2计算肿瘤的体积。

5)体积测量结束后,脱颈处死裸鼠。

6)剥离瘤体并放入4%甲醛中固定。

乙肝病毒基因突变及免疫作用对慢性乙型肝炎患者HBV相关血清学指标的影响

2.2HBVORF-PreC/C和ORF-S基因PCR、TA克隆与测序

 

2.2.1HBVDNA提取

(1)吸取1000μl血清至2ml的离心管中,不足1000μl用PBS缓冲液补足至1ml(血清量至少需要200μl);(2)加入0.8mlBufferAC至离心管,吸取5.6μlCarrierRNA至离心管盖子中;(3)合盖,上下颠倒3次混匀,然后再涡旋10秒;(4)室温(20-25℃)静置10-15min(最长不能超过15min);(5)离心1200×g,3min,弃上清,轻敲管底部数次;(6)加300μlBufferAR加热至60℃,加入20ul蛋白酶K,再充分涡旋;(7)在40℃水浴中静置10min。并且在第5min、10min时,各涡旋5秒;

(8)短暂离心,以确保离心管盖子中的液体回到管内;(9)加300μlBufferAB,充分涡旋混匀,再次短暂离心(目的是使离心管盖子中的液体回到管内);(10)吸取700μl上述溶解产物至过滤柱中,合盖,离心,3000-5000×g,1min;(11)倒掉滤液,加入500μlBufferAW1至过滤柱中,离心,6000×g,1min;(12)倒掉滤液,加入500μlBufferAW2至过滤柱中,离心,20000×g,3min;(13)弃掉收集管,将柱子放入1.5ml无酶的离心管中,打开柱子,加30μl洗脱液BufferAVE(确保柱子中央滤过膜润湿),离心,6000×g,1min;(14)重复洗脱,再加30μl洗脱液BufferAVE,离心,6000×g,1min。HBVDNA提取液直接用于下一步分子生物学实验或-20℃保存备用。

 

2.2.2HBVORF-PreC/C和ORF-S基因引物

ORF-PreC/C第一轮引物:PreC/C-1F(上游引物):5'-CCTATGGGAGTGGGC

3';PreC/C-1R(下游引物):5'-AGAATATGGTGACCC-3';ORF-PreC/C第二轮引物:PreC/C-2F(上游引物):5'-ACTGCAGGCACCATGCAACTTTTTCAC-3';PreC/C-2R(下游引物):5'-TGTCGACCTAACATTGAGATTCCCGAG-3'。ORF-S第一轮引物:S-1F(上游引物):5'-AGAAGAAGAACTCC-3';S-1R(下游引物):5'-GCAACGGGGTAAAGG-3';ORF-S第二轮引物:S-2F(上游引物):5'-GTCACCATATTCTTGGGAACS-3';S-2R(下游引物):5'-CATATCCCATGAAGTTAAGG-3'。

 

2.2.4PCR产物验证

配制浓度为1%琼脂糖凝胶,取6μlPCR产物与1μl10×LoadingBuffer混匀上样,电压90V,时间45min。然后在凝胶成像系统中观察条带。ORF-PreC/C基因的条带大致在DNAmarker的750bp位置,ORF-S基因的条带在DNAmarker的1000bp与2000bp之间。根据观察PCR产物条带与DNAmarker的相对的位置初步验证PCR产物。

 

2.2.5PCR产物纯化

对上述PCR产物进行纯化,除去PCR反应液中多余的酶蛋白、DNA引物、dNTP等,回收得到的高纯度的目的DNA片段,以利于后续试验。具体步骤如下:(1)向PCR反应液中加入3倍体积量的BufferDC(如果需加入的BufferDC量不足100μl时应加入100μl),然后均匀混合;(2)将试剂盒中的SpinColumn置于收集管上;(3)将操作(1)的溶液转移至SpinColumn中,室温离心,12,000rpm,1min,弃滤液;(4)将700μl的BufferWB加入SpinColumn中,静置5min,室温离心,12,000rpm,30秒,弃滤液;(5)重复操步骤(4);(6)将SpinColumn置于收集管上,室温离心,12,000rpm,1min;(7)将SpinColumn置于新的1.5ml无酶离心管,在SpinColumn膜的中央处加入30μl的灭菌水洗脱液ElutionBuffer,室温静置1min;(8)室温离心,12,000rpm,1min,洗脱DNA。2.2.6HBVORF-PreC/C和ORF-S基因加“A”尾反应PCR反应得到的HBVORF-PreC/C和ORF-S基因为平滑末端DNA片段,加30个循环

“A”尾反应可以在其3'末端添加一个“A”碱基,使得目的基因与载体连接成为可能,从而大大的提高了克隆效率和实验成功率。具体步骤如下:(1)在微量离心管中配制下列加“A”反应体系,全量为50μl。

10×A-TailingBuffer5μl

dNTPMixture4μl

A-TailingEnzyme0.5μl

纯化的DNA片段0.5-5μg

灭菌水upto50μl

合计50μl

(2)72℃反应20min;(3)冰中静置1-2min。

 

2.2.7A-TailingDNA片段与T载体的连接转化

将A-TailingDNA片段与T载体进行连接反应,形成含有ORF-PreC/C或ORFS的重组质粒,转入JM109感受态细胞中培养。具体步骤如下:(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液,全量为5μl。试剂名称使用量T克隆载体1μlA-TailingDNA溶液0.5-4μl灭菌水upto5μl(2)25℃反应5-10min;(3)全量(5μl)加入至100μlJM109感受态细胞中,轻弹混匀,冰中放置30min;(4)42℃水浴中加热45秒后,再在冰中放置1min;(5)加入250μlSOC培养基,220rpm,37℃震荡培养1小时;(6)在含有Amp(浓度为100μg/mL)的LB平板培养基上培养(37℃,培养12-16小时),形成单菌落。(7)每份标本随机挑选25-30个菌落,放入3mL含有AMP的LB液体培养基中,220rpm,37℃培养12-16小时。

10×A-TailingBuffer5μl

dNTPMixture4μl

A-TailingEnzyme0.5μl

纯化的DNA片段0.5-5μg

灭菌水upto50μl

合计50μl

 

2.2.8重组质粒鉴定

采用PCR方法确定载体中是否插入了目的基因片段,具体步骤如下:(1)在微量离心管中配制下列反应液,总量50μl。

Premix25μl

M13F2μl

M13R2μl

菌液1μl

Rnase-freeH2O20μl

合计50μl

(2)PCR反应程序:95℃10s94℃30s55℃30s72℃60s

(3)将上述PCR产物进行电泳,确认载体中插入片段的长度大小(方法同前)。

 

2.2.9质粒DNA提取

将PCR方法验证的阳性菌液进行质粒抽提,以得到含有HBVORF-PreC/C、ORF-S基因的质粒DNA,具体步骤如下:(1)取1.5-4.5ml过夜培养的菌液,室温离心,9,000rpm,30秒,弃上清,收集菌体,尽可能的去除干净;(2)用250μl溶液P1重悬菌体沉淀,涡旋震荡至彻底悬浮;(3)加250μl溶液P2,温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解,直到溶液变得清亮;(4)加400μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-10次,室温放置5min,室温13,000rpm离心10min,小心取上清;(5)将吸附柱安置于收集管上,将上一步所得上清液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中,溶液太多可分两次加入),13,000rpm离心1min,弃

Premix25μl

M13F2μl

M13R2μl

菌液1μl

Rnase-freeH2O20μl

合计50μl

滤液;(6)加入500μl去蛋白液PE,13,000rpm离心30-60秒,弃滤液;(7)加入500μl漂洗液WB,13,000rpm离心30-60秒,弃滤液;(8)重复步骤(7)一次,13,000rpm离心30-60秒,弃滤液。空柱13,000rpm离心2min。室温静置3-5分钟,除去残留乙醇;(9)取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加60-100μl洗脱缓冲液(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热),室温放置1min,13,000rpm离心1min洗脱DNA。

 

2.4细胞因子检测

运用RayBiotech芯片检测宿主相关细胞因子,该芯片检测原理是双抗体夹心法(Doubleantibodysandwich-basedmethod)。这一过程由RayBiotech公司完成,具体步骤如下:(1)玻片芯片干燥将玻片芯片从盒子中取出来,在室温平衡20-30min后,将包装袋打开,揭开密封条,然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。(2)标准品的配置。2)加500µl的样品稀释液到细胞因子标准混合物的小管中,重新溶解标准品。打开小管前,先快速的离心,轻轻的上下抽打溶解粉末,标记这个小管为Std1;3)分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std5,添加200µl的样品稀释液到每个小管中。4)抽取100µl的Std1加入到Std2中轻轻混合,然后从Std2中抽取100µl加入到Std3中,如此梯度稀释至Std5。5)抽取100µl的样品稀释液到另一个新的离心管中,标记为CNTRL,作为阴性对照。

(3)芯片操作流程1)每个孔中加100µl的样品稀释液,室温摇床上孵育1h,封闭定量抗体芯;2)抽去每个孔中的缓冲液,添加100µl的标准液和样品(2倍稀释)到孔中,在摇床上4℃过夜孵育;3)清洗。抽去每个孔中的标准品或样品,1×洗液I清洗5次,每次5min室温摇床震荡,每孔150µl的1×洗液I,每次清洗要抽干净洗液,用去离子水稀释20×洗液I。抽去每个孔中的1×洗液I,加入1×洗液II清洗2次,每次5min室温摇床震荡,每孔150µl的1×洗液II,每次清洗要抽干净洗液,用去离子水稀释20×洗液II;4)检测抗体混合物的孵育。离心检测抗体混合物小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心。添加80µl的检测抗体到每个孔中,室温摇床上孵育2小时;5)清洗。抽去每个孔中的检测抗体,1×洗液I清洗5次,每次5min室温摇床震荡,每孔150µl的1×洗液I,每次清洗要抽干净洗液,然后加入1×洗液II清洗2次,每次5min室温摇床震荡,每孔150µl的1×洗液II,每次清洗要抽干净洗液;6)Cy3-链霉亲和素的孵育。离心Cy3-链霉亲和素小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心。添加80µl的Cy3-链霉亲和素到每个孔中,用铝箔纸包住玻片避光孵育,室温摇床上孵育1个小时;7)清洗。抽去每个孔中的Cy3-链霉亲和素,1×洗液I清洗5次,每次5min室温摇床震荡,每孔150µl的1×洗液I,每次清洗要抽干净洗液;8)荧光检测。a:将玻片框架拆掉,小心不要用手接触到玻片印制抗体的一面;b:将玻片放置在玻片清洗管中,添加约30ml的1×洗液I,能整个覆盖住玻片,在室温摇床上震荡15min,弃去1×洗液I,添加约30ml的1×洗液II,在室温摇床上震荡5min;c:去除玻片的残留洗液。将玻片放置在玻片清洗管/干燥管中,不盖盖子,在1000rpm离心3min;d:采用激光扫描仪例如AxonGenePix扫描信号,采用Cy3或者绿色通道(激发频率=532nm)。

12/15-LOX表达/激活参与糖尿病认知功能障碍机制

 

 

 

 

                                               实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)