关键词:PRDX2   结肠癌   科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

 

2.2iTRAQ多重化学标记串联质谱比较过表达miR-125b前后SKOV3细胞中蛋白质的差异

2.2.1蛋白样本的提取和定量(1)将三组细胞株传入75cm2培养瓶中,每组传6瓶,扩大培养。待每瓶细胞融合率达90%时,消化细胞,离心收集于1mlEP管中,做好标记;(2)在收集的细胞中加入蛋白裂解液(含7摩尔尿素,1mg/mlDNaseI,1mMNa3VO4,1mMPMSF)。4℃,15000rpm,离心30min,取上清液;(3)根据考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒说明书,测定样品蛋白的浓度。

 

2.2.2酶解

(1)蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中;(2)加入6μlDTT,37度反应1小时;(3)加入2μlIAA,室温60分钟;(4)将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中,12,000转离心20分钟,弃掉收集管底部溶液;(5)加入iTRAQ®试剂盒中的DissolutionBuffer100μl,12,000转离心20分钟,弃掉收集管底部溶液,重复3次;(6)更换新的收集管,在超滤管中加入胰蛋白酶,总量2-4μg(与蛋白质量比1:50-100),体积50μl,37摄氏度反应过夜;(7)次日,12,000转离心20分钟,酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部;(8)在超滤管中加入50μlDissolutionBuffer,12,000转再次离心20分钟,与上步合并,收集管底部共得到100μl酶解后的样品。

 

2.2.3标记

(1)从冰箱中取出iTRAQ®试剂,平衡到室温,将iTRAQ®试剂离心至管底;(2)向每管iTRAQ®试剂中加入150μl有机溶剂(4标试剂为乙醇),涡旋振荡,离心至管底;(3)取50μl样品(100μg酶解产物)转移到新的离心管中;(4)将iTRAQ®试剂填加到样品中,涡旋振荡,离心至管底,室温反应2小时;(5)加入100μl水终止反应;(6)为了检测标记效率及定量准确性,从4组样品中各取出1ul混合,用Ziptip脱盐后进行质谱鉴定,确认标记反应良好;(7)混合标记后的样品,涡旋振荡,离心至管底;(8)真空冷冻离心干燥;(9)抽干后的样品冷冻保存待用。

 

2.2.4高pH反相分级

(1)使用400µg多肽段混合物或者E.coli蛋白抽提物进行分离,检测系统情况;(2)将标记抽干后的样品用150μl流动相A复溶,涡旋振荡,12,000转离心20分钟,吸取上清上样;(3)准备50个空白1.5ml离心管,依次标记为1-50,用于收集分离得到的组份1-50;(4)流速0.8ml/min,分离梯度如下:时间(分钟)B%055530154538469054.590555655(5)从第5分钟开始,依次收集每分钟洗脱物到1-50号离心管中;(6)真空冷冻离心干燥;(7)抽干后的样品冷冻保存待用。

 

2.2.5纳升级反相色谱-TripleTOFTM5600进行蛋白质分析

(1)根据紫外监测情况,将高pH反相分离得到的50个组份合并为10个组份,合并时采用30μl2%ACN,0.1%FA,加入第一个离心管,涡旋振荡并离心后,转入第二个离心管,依次直至合并组份最后一管;(2)12,000转离心10分钟,吸取上清上样;(3)上样体积8μl,采取夹心法上样;(4)LoadingPump流速2μl/min,15分钟;(5)分离流速0.3μl/min,分离梯度根据组份1-4和5-10稍作调整,具体梯度如下:时间(分钟)B%(组份1-4)B%(组份5-10)0550.1106602522854843868080908080915510155(6)质谱参数设置:a)源气参数(根据不同仪器状态进行优化)Ionsprayvoltage:2.3kv;GS1:6;Curtaingas:35;DP:100;b)TOFMS:m/z:350-1500;accumulationtime:0.25s;c)ProductIonScan:IDAmumber:30;m/z:100-1500;accumulationtime:0.1s;Dynamicexclusiontime:25s;RollingCE:enabled;AdjustCEwhenusingiTRAQ®reagent:enabled;CES:5;2.3WesternBlot检测miR-125b对ERBB2基因的影响

 

2.3.1总蛋白样品的提取和浓度测定

(1)收集三组细胞株,用4℃遇冷PBS洗涤三次,弃净PBS后把培养瓶置于冰上。(2)按1ml裂解液加10μlPMSF(100mM),摇匀置于冰上(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。(3)每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。(4)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧,然后移至1.5ml离心管中,4℃,12000rpm离心15min。(5)离心后取上清,移至离心管中,-20℃保存备用。(6)使用BCA蛋白浓度检测试剂盒测定蛋白样品的浓度并调整浓度。2.3.2SDS-PAGE电泳

(1)按照每4μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液(5×)的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液,煮沸变性3-5min,备用。(2)配制8%的分离胶和5%的浓缩胶

8%分离胶5%浓缩胶

Total10ml3ml

蒸馏水3.3ml2.1ml

30%丙烯酰胺2.7ml0.5ml

1MTrispH8.83.8ml0.38ml

10%SDS0.10.03ml

10%过硫酸铵0.10.03ml

TEMED0.0060.003ml

(3)分离胶加入TEMED后立即混匀即可灌胶,避免产生气泡,灌好后胶上加一层无水乙醇,使胶凝得更快,室温放置30min。当无水乙醇和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝,倒去胶上上层液体,用滤纸吸干。配制浓缩胶后立即灌胶,并迅速插入梳子。(4)待浓缩胶凝固后,加入1×电泳缓冲液,小心取出梳子。用微量进样器上样,每孔加15μl样品。(5)恒定电压80V电泳,当样品完全进入分离胶时,调电压至100V。电泳至溴酚蓝距胶底部1cm处即可终止,取下胶准备转膜。

 

2.3.3转膜

(1)将剪好的PVDF膜用甲醇浸泡2min,然后将PVDF膜、滤纸、海绵放入加有电转缓冲液的搪瓷盘里。(2)将夹子打开使黑色一面保持水平。上面依次放上海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵后,赶走凝胶和PVDF膜之间的气泡,合起夹子。(3)将夹子放入电泳槽中,使夹子的黑面对槽的黑面,夹子的白面对槽的红面。接通电源,将电泳槽移至冰浴中,设恒定电压100V,转膜100min。

 

2.3.4免疫反应

(1)将电转后的PVDF膜用TBST溶液洗涤几次,放入封闭液中,室温下摇床上摇动封闭1h。(2)用封闭液将一抗稀释至适当浓度(1:500),将PVDF膜放入稀释好的一抗溶液中,4℃孵育过夜。第一天用TBST漂洗三次,每次7min。(3)用封闭液将二抗稀释至适当浓度(1:1000),将PVDF膜放入二抗溶液,室温孵育1h。取出膜用TBST漂洗三次,每次7min。(4)用滤纸吸去PVDF膜上多余水分,放入蜡盘中,蛋白面朝上。在暗室中,将ECL试剂盒中A、B两种试剂等体积混合后,均匀滴加于膜表面上,1min后用凝胶成像仪采集图像。

 

甲状腺激素T3对心外膜祖细胞增殖的作用及其机制

1.2方法

1.2.1胚胎心外膜祖细胞的培养

(1)包被六孔板

无菌操作下,每孔加入3mL经0.22μm过滤器过滤的1%明胶以包被六孔板20min,之后用一次性吸管吸干明胶溶液,开启超净台紫外线等待其自然晾干。所培养细胞用于做细胞荧光染色时,需提前在六孔板内放入一片20mm×20mm的无菌盖玻片,再用明胶铺板。所培养细胞用于CCK-8、流式细胞技术检测或qRT-PCR时六孔板下无需包被盖玻片。

(2)解剖出胚胎心脏步骤

1)开启超净台紫外线照射30min;

2)用断颈椎法处死孕鼠;

3)无菌操作下取出胎体放于盛有无菌冰PBS的培养皿中,并小心剥离出完整胚胎(图1.1A、B);

4)在体视显微镜下小心分离出胚胎心脏,并去除心房及流出道组织,保留完整心室组织(图1.1C、D);

5)用无菌1000μL枪头将心室组织转移到盛有高糖DMEM的50mL离心管中,存放于冰上。

注意:所有解剖用物品均放于超净台紫外照射30min,解剖用的手术器械均为高温高压灭菌处理,解剖出心室组织必须在一小时之内种植。

(3)种植心室组织

1)将心室组织转移到六孔板内,用一次性吸管吸取到每个孔内,确保心室组织在六孔板或者盖玻片中心,并滴加一定量的DMEM保持心室组织块的湿润(注意:若细胞用来做PCR或者流式等需要大量细胞的实验,那么在每一个孔内可以种植2-3个心室组织。但应注意的是每个心室组织应间隔开,至少间隔一个心室组织直径的距离,避免细胞生长区域不足从而抑制生长);

2)用一次性吸管将多余的DMEM吸出,小心地盖压无菌盖玻片于心室组织块之上,避免组织块漂浮(图1.1E);3)轻柔滴加所需量的培养基于盖玻片四周,盖好盖子并做好标记;4)轻柔地将六孔板转移到湿润的37℃,5%CO2细胞培养箱内。

注意:盖压玻片时心室四周的DMEM量不能过少,否则将把心室组织块压得过扁从而使组织碎裂,不利于EPCs的爬出;心室种植后的第一二天要尽量减少对六孔板的移动以免组织块粘附不牢甚至漂浮出盖玻片外不利于心外膜祖细胞的爬出,或者细胞爬出粘附在不同部位不利于细胞的整体生长。

(4)去除心室组织块

1)24~48小时后显微镜下观察,如果心脏组织周围明显细胞爬出则去除组织。取出六孔板,用1mL注射器针头挑起盖玻片,镊子夹取翻转后移入另一六孔板中,加入2mL原代细胞培养液,移入原代细胞培养箱中继续培养;

2)同时,用一次性吸管小心移除原六孔板中的心室组织,吸走剩余培养基;

3)2mL无菌PBS液润洗孔板,重新滴入2mL原代细胞培养液,培养箱中继续培养;

4)如果做药物干预后细胞免疫荧光、流式细胞技术检测细胞周期及qRT-PCR实验时,则直接换用1%FBSDMEM培养基加药物继续培养;

5)如果所培养心外膜祖细胞用于CCK-8检测,则继续用10%FBSDMEM培养基继续培养72小时后再消化细胞进行下一步实验。

 

1.2.2细胞免疫荧光步骤

(1)吸走六孔板中细胞培养基,PBS液洗5分钟×2次;

(2)4%多聚甲醛室温固定细胞15分钟;

(3)PBS洗5分钟×3次;

(4)0.25%Triton破膜,37℃10分钟;

(5)PBS洗5分钟×3次;

(6)10%山羊血清溶液37℃封闭30分钟;

(7)一抗4℃过夜孵育(一抗信息参照表1.1);

(8)PBS洗10分钟×3次;

(9)二抗37℃孵育45分钟;

(10)PBS洗8分钟×3次;

(11)DAPI原液染核5分钟;

(12)PBS洗3分钟×3次;

(13)抗荧光淬灭剂封片;

(14)荧光共聚焦显微镜观察拍照。

 

1.2.3细胞消化及计数

(1)胰酶放入37℃孵箱中恢复活性;

(2)取出培养的心外膜祖细胞的六孔板,轻轻吸走培养基,无菌PBS小心润洗2次;

(3)每孔中加入胰酶600μL,37℃孵箱中孵育2分钟;

(4)镜下观察细胞成片浮起后,立即加入700μL含10%胎牛血清的DMEM培养基中和胰酶;

(5)一次性吸管反复吹打细胞数十次,并镜下观察细胞至均匀散开;

(6)将细胞悬液移入15mL无菌离心管中,800转/分钟,离心5分钟;

(7)离心完毕,用移液枪尽量吸走上清液,重新加入300μL无胎牛血清的DMEM培养基,充分混匀细胞;

(8)吸取20μL细胞悬液,细胞计数板计数四个大方格细胞数目分别为A、B、C、D个,计算细胞浓度E;

1.2.4CCK-8实验测定细胞增殖水平

(1)标注96孔板各组编号,孔板周围孔弃用;

(2)周围弃用孔加入无菌PBS液,以缓解蒸发;

(3)根据细胞计数结果,按照每孔种植3000个细胞计算每孔所需细胞悬液体积为VmL(每孔总量100μL);

(4)每孔先加入所需的细胞培养基(用无FBS的DMEM,使细胞状态同步);

(5)加入所需量的细胞悬液VmL;

(6)24小时后细胞贴壁,去除原培养基,加入新的培养基(1%FBS的DMEM)及干预药物(T3、BPA、U0126)放入细胞培养箱继续培养(根据实验目的决定培养时间:24h,48h,72h);

(7)将到达时间点各组细胞去除原细胞培养液,用新的培养基洗涤细胞两次后每孔加入100μL培养基及10μLCCK-8试剂;

(8)继续将96孔板放置于培养箱孵育2小时;

(9)酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度;

注意:设置加有培养基及CCK-8试剂而没有细胞的孔为对照组;96孔板培养细胞是置于培养箱最下层,以防蒸发;加入CCK-8试剂时一定不要产生气泡,以防干扰测定结果;每组至少5孔,剔除最高及最低光密度(Opticaldensity,OD)值,并绘制标准曲线。

 

1.2.5流式细胞技术测定细胞周期

(1)细胞培养从剔除组织后即开始药物干预,每一6孔板为一组,随机加药;

(2)到时间点后行细胞消化及计数,消化方法同1.2.3;

(3)每组细胞消化后用PBS洗涤,1000rpm,5minx2次;

(4)加入1mL,-20℃预冷的75%乙醇,边振荡边加,保存于1.5mLEP固定24小时;

(5)样品送重庆医科大学生命科学院流式细胞室检测。

 

1.2.6qRT-PCR测定mRNA的表达

(1)细胞RNA的提取

1)超净台紫外照射15分钟;

2)取出培养Tbx18+心外膜祖细胞的六孔板,一次性吸管吸净六孔板内培养基,无菌PBS溶液反复润洗2次;

3)六孔板斜放,移液枪吸取1mLTrizol并依次反复吹打孔板内细胞,10次/孔;

4)将裂解细胞后的Trizol溶液移入1.5mL无菌EP管中,冰上静置5分钟;

5)加入200μL氯仿,充分震荡15秒,冰上静置3分钟;

6)放入低温离心机,12000转/分钟,4℃离心15分钟;

7)取上层水相200μL入另一无菌EP管中,加入200μL异丙醇,轻摇6-7下,4℃静置10分钟;

8)放入低温离心机,12000转/分钟,4℃离心10分钟;

9)小心弃去上清液,加入1ml75%乙醇(750μL无水乙醇+250μLDEPC水)润洗,轻晃数下;

10)放入低温离心机,12000转/分钟,4℃离心5分钟;

11)弃去上清液,超净台内开盖干燥RNA5分钟;

12)加入8μLDEPC水溶解RNA沉淀;

13)分光光度仪器测定RNA浓度及260/280比值,准备行逆转录反应。

(2)RNA的逆转录

1)去除混杂的基因组DNA反应

根据TAKALA逆转录试剂盒说明书,冰上配制10μL反应体系如下:

试剂使用量

②5×gDNAEraserBuffer2.0μL

① gDNAEraser1.0μL

TotalRNA1/conμL

⑥RNaseFreedH2OUpto10μL

上机程序:42℃2分钟,CorT10分钟,4℃4分钟;或者室温放置5分钟。

2)逆转录反应

冰上配制反应液:

试剂使用量

步骤(1)中的反应液10μL

② PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0μL

⑤RTPrimerMix1.0μL

③ 5×PrimeScriptBuffer24.0μL

⑥RNaseFreedH2O4.0μL

逆转录反应程序:

反应温度时间

37℃15分钟

85℃5秒

4℃4分钟

3)经逆转录合成的cDNA中加入80μL灭菌双蒸水至100μL后,分装并置于﹣20℃保存。

 

                                              实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)