关键词:miR-125b    卵巢癌SKOV3细胞    细胞增殖    细胞迁移    科进    Kirgen    卧宏生物    WHB    爱思进    Axygen    科晶    Cystalgen    肖特    SCHOTT

 

2.2MTT检测细胞增殖

(1)消化收集稳定感染细胞,以2×103个/每孔的细胞数接种于96孔培养板中间,接种细胞四周的孔用PBS填满,防止培养基挥发。每孔体积为100μl,每组设5个复孔,将0h、24h、48h、72h四个时间点分别接种于四个培养板中。将接种好的培养板放入培养箱中静置2-3h。(2)取出0h培养板,每孔加入10μlMTT(在超净工作台中避光操作)。放入培养箱孵育4h。(3)4h后,小心吸去孔内培养上清液,注意不要把结晶物吸掉。每孔加入100μlDMSO,避光震荡10min,使结晶充分溶解。(4)选择490nm波长,用酶标仪测定各孔光吸收值,纪录结果。(5)24h、48h和72h时,重复2步骤2-4。(6)统计学分析数据。2.3划痕实验检测细胞迁移

(1)在培养板接种细胞前,用marker笔在培养板的背面均匀划三条直线(约1cm一道),方便拍照时定位同一个视野。(2)划痕前一天,消化收集稳定过表达miR-125b的SKOV3细胞,接种于六孔板中,每孔约5×105个,使贴壁后铺满板底为宜。(3)待细胞铺满板底后,用200μl枪头垂直于培养板背面的直线,划出均匀的竖线。(4)吸去培养液,用PBS轻轻洗三次,洗去划痕产生的细胞碎片,避免把壁上细胞冲掉。加入含1%胎牛血清的培养基,放入培养箱静置2h后,在显微镜下拍照记录。继续培养(5)在24h、48h时取出,在同一位置点重复拍照记录。(6)根据图片数据分析实验结果。

 

2.4Transwell侵袭实验检测细胞的侵袭

(1)实验前准备:将Transwell小室及24孔培养板放入4℃冰箱中遇冷,基质胶放到冰上在4℃冰箱中过夜融化。(2)基质胶的稀释:将基质胶用无血清培养基配制成50mg/LMatrigel1:8稀释液。采用梯度稀释法:将40μl无血清培养基加入40μl基质胶中,小心混合均匀,避免气泡产生;再将80μl无血清培养液加入上一步的稀释液中,混合均匀;再吸160μl无血清培养基加入上一步稀释液中,混合均匀;最后再加入40μl无血清培养基。全程在冰上操作,稀释液现配现用。(3)包被基底膜:取刚刚配制的50mg/LMatrigel1:8稀释液50μl包被transwell小室底部膜的上室面,放入37℃孵箱2h,使Matrigel聚合成凝胶。(4)水化基底膜:在小室的上室中加入100μl无血清培养基,37℃静置30min,使基质胶水化。(5)消化收集细胞,离心弃除培养液,用PBS洗细胞2遍,用无血清培养基重悬。调整细胞密度至3×105。(6)取细胞悬液200μl加入小室上室。24孔板下室加入500μl含10%胎牛血清的培养基,上室和下室间避免产生气泡。(7)放入培养箱培养24h。(8)24h后,取出小室用棉签轻轻擦去基质胶和上室的细胞。然后放入4%甲醛中固定15min,PBS清洗2次,室温风干。(9)用0.25%的结晶紫染色5min,PBS轻洗2次。(10)计数照相:将小室反过来底朝上在显微镜下计数,取5个视野拍照计数。

 

                                            实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)