关键词:木犀草素 乳腺癌 细胞侵袭 上皮间质转换 科进 Kirgen 卧宏生物 WHB 爱思进 Axygen 科晶 Crystalgen 肖特 SCHOTT

 

1.2方法

1.2.1细胞培养及分组处理

乳腺癌细胞系MDA-MB-231和BT549细胞于DMEM培养基(含10%的胎牛血清,1%的青霉素-链霉素双抗)中,置于含5%CO2的细胞培养箱,37°C恒温孵育。待细胞长至对数生长期时用于细胞实验。在研究木犀草素对乳腺癌细胞生物学效应及机制的细胞实验中,将细胞均分为5组,分别为空白对照组、DMSO溶媒组、10µM木犀草素组、30µM木犀草素组、100µM木犀草素组。鉴于我们前期预实验中,DMSO对细胞的影响与空白组相比并无统计学差异,因此,我们后续实验将细胞分为4组,即空白对照组、10µM木犀草素组、30µM木犀草素组、100µM木犀草素组。由于在不同浓度木犀草素对乳腺癌侵袭转移的结果中发现,100µM浓度木犀草素对乳腺癌细胞的生物学效应与空白组相比,较10µM、30µM浓度木犀草素对乳腺癌细胞的生物学效应与空白组相比,统计学差异更显著,因此,在证实b-catenin是木犀草素对乳腺癌细胞侵袭转移、上皮间质转化作用的靶点的实验中,选择100µM浓度的木犀草素用于实验,即将细胞分为2组,分别为Ad-GFP+木犀草素组和Ad-b-catenin+木犀草素组。

1.2.2腺病毒b-catenin转染乳腺癌细胞的实验

(1)对数生长期乳腺癌细胞MDA-MB-231消化离心,分为两组,Ad-GFP组和Ad- b-catenin组,37℃,5%CO2培养箱培养。

(2)6h待细胞贴壁长出形态后,弃上清,Ad-GFP组更换为含带GFP标记的空载病毒的无血清培养液,Ad-b-catenin组更换为含GFP标记的b-catenin病毒的无血清培养液,37℃,5%CO2培养箱培养。

(3)8h后,弃上清,更换为含10%FBS的正常细胞培养液,37℃,5%CO2培养箱培养。

(4)24h后,显微镜下观察细胞转染率是否达95%以上,并用于实验。

1.2.3划痕实验检测乳腺癌细胞迁移能力

(1)对数生长期乳腺癌细胞系MDA-MB-231或BT549细胞消化离心,接种于6孔板中,细胞密度70%,37℃,5%CO2培养箱培养。

(2)24h后待细胞密度刚好长至100%时,用灭菌牙签比着无菌直尺,在每孔的中央轻轻划下一条直线,无菌PBS洗弃划下的细胞。

(3)加入新鲜培养基,空白组对照组不做任何处理,药物处理组分别加入含不同浓度木犀草素的含药培养基,拍照(0h)后,于37℃,5%CO2培养箱中孵育。

(4)18h后取出培养板,显微镜下观察不同处理组的细胞迁移情况并拍照(18h)。

1.2.4Transwell实验检测乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力

Transwell小室不包被或包被Matrigel基质胶(1mg/mL)分别用于检测乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力。

(1)对数生长期乳腺癌细胞系MDA-MB-231或BT549细胞消化离心,接种于6孔板中,细胞密度50%,37℃,5%CO2培养箱中培养。

(2)6h待细胞贴壁长出形态后,空白对照组不做任何处理,药物处理组分别加入含不同浓度木犀草素的含药培养基,37℃,5%CO2培养箱中孵育。

(3)24h后,分别收集各孔细胞制成单细胞悬液加入小室上室中(2.5×105/200µL),下室中加入含10%胎牛血清的DMEM培养液750µL,37℃,5%CO2培养箱中孵育。

(4)8h后,PBS洗去培养液,用0.25%结晶紫染色液染色15min,再用PBS洗去染料并用棉签轻轻拭去小室上面未穿透的细胞。

(5)显微镜下随机选取5个视野,记录细胞数并拍照。

1.2.5免疫细胞化学实验

(1)对数生长期乳腺癌细胞MDA-MB-231消化离心,以适宜细胞密度铺于24孔板,37℃,5%CO2培养箱培养。

(2)6h待细胞贴壁长出形态后,空白对照组不做任何处理,药物处理组加入含木犀草素的含药培养基。37℃,5%CO2培养箱中培养。

(3)24h后,弃上清,PBS洗弃残余培养基,预冷4%多聚甲醛固定细胞10min,PBS洗3×5min。

(4)0.1%TritonX-100通透细胞膜10min,PBS洗3×5min。

(5)含1%BSA的PBS封闭30min,孵一抗4℃过夜。

(6)PBS洗3×5min,孵二抗,室温避光孵育1h。

(7)PBS洗3×5min,室温避光孵育F-actin30min。

(8)PBS洗3×5min,DAPI室温避光染核20min。

(9)PBS洗3×5min。

(10)倒置荧光显微镜下观察并拍照。

1.2.6细胞微球体形成实验

(1)实验前,无菌24孔板和灭菌枪头先放在4℃预冷。

(2)24孔板铺Matrigel基质胶:取出预冷的24孔板于冰上,预冷灭菌枪头吸取20µl冷基质胶于24孔板的孔中央,立即四面轻轻摇晃板子,使得基质胶平铺于孔底,将铺好基质胶的培养板放于细胞培养箱20min,使基质胶凝固。

(3)对数生长期乳腺癌细胞消化离心,制成单细胞悬液,以适宜细胞密度铺于事先铺好基质胶的24孔板中,空白对照组不做任何处理,药物处理组加入木犀草素。

(4)用含5%基质胶的无血清培养基培养,每2天更换一次培养液。

(5)7天后,显微镜下观察细胞微球体形成状态并拍照。

1.2.7流式细胞术分析乳腺癌细胞表面CD24/CD44的表达

(1)对数生长期乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞消化离心,以适宜细胞密度铺于6孔板中,37℃,5%CO2培养箱中培养。

(2)6h待细胞贴壁长出形态后,空白对照组不做任何处理,药物处理组加入含木犀草素的含药培养基,37℃,5%CO2培养箱中培养。

(3)24h后,胰酶消化每孔细胞,注意不要消化过度,收集细胞于灭菌的1.5mLEP管中。

(4)4°C,1000转/分钟,离心5min,小心弃去上清,可见管底有薄层细胞附着。

(5)PBS洗2次,1000转/分钟,离心5min,充分洗尽残余的培养基,最后用1mL

PBS悬浮细胞。

(6)管中加入APC标记的抗CD24抗体和PE标记的抗CD44抗体,4°C避光孵育10min。

(7)在4°C,1000转/分钟条件下离心5min,弃去上清,使细胞重悬于1mLPBS中,避光送流式,检测细胞表面CD24/CD44的表达。

1.2.8QRT-PCR检测乳腺癌细胞中mRNA的表达水平

(1)实验前准备

1)RNase-free水的制备:向超纯水中加入DEPC至终浓度为0.1%,用121°C高压灭菌锅灭菌,室温冷却后,保存于4°C冰箱。

2)无RNA酶玻璃容器的准备:将所用玻璃瓶用0.1%DEPC水浸泡过夜,高压并烘干。

(2)乳腺癌细胞中总RNA的提取

1)CO2培养箱中取出处理后待提取细胞总RNA的细胞,弃上清,用PBS洗弃残余培养基。

2)加入500µLRNAisoPlus,在冰上用无RNA酶的枪头反复轻轻吹打下培养瓶上的贴壁细胞,随后转至1.5mL无RNA酶EP管中,室温静置5min。

3)提前打开离心机4°C预冷,在4°C条件下,将匀浆液12000g离心5min,小心吸取上清,移至新的1.5mL的无RNA酶的EP管中。

4)将100µL氯仿加入匀浆液中,盖紧EP管的盖子,用手上下剧烈震摇15s,待匀浆液充分乳化后,室温静置5min。

5)在4°C条件下,12000g离心15min,将EP管从离心机中取出,可以看到此时匀浆液分为3层,从上到下依次为:无色的上清液、中间的白色蛋白层和下层带有颜色的有机层,吸取上清到新的1.5mL无RNA酶的EP管中。

6)将等体积的异丙醇加入上清中,用手轻轻上下颠倒使得充分混合均匀,在室温静置10min。

7)在4°C条件下,12000g离心10min,可见离心管底有少量白色RNA沉淀。

8)弃上清,沿离心管壁缓慢加入75%的无酶乙醇1mL,轻轻的上下颠倒EP管,洗涤EP管,在12000g,4°C条件下离心5min,弃上清。

9)室温干燥RNA沉淀约5min,向管中加入适量的RNase-free水使沉淀充分溶解。

10)将提取的总RNA于-80°C保存备用。

(3)cDNA的合成

1)基因组去除反应

向无RNA酶的专用于PCR实验的EP管中依次加入5×gDNAEraserBuffer2.0µL,gDNAEraser1.0µL,totalRNA5.0µL,RNaseFreeddH2O2.0µL,轻轻混匀,室温静置5min。

2)反转录反应

在冰上配制反应液,向1)中的反应液中依次加入RNaseFreeddH2O4µL,5×PrimerScriptBuffer24.0µL,RTPrimerMix1.0µL,PrimeScriptRTEnzymeMixI1.0µL,轻轻混匀,在42°C条件下使用GeneSpecificPrimer进行逆转录反应15min,当合成的cDNA需要长时间保存时,于-20°C保存。(4)PCR的扩增依次按下列组分配制PCR反应液SYBRPremixExTaqII(2×)12.5µL,PCRForwardPrimer(10µM)1µL,PCRReversePrimer(10µM)1µL,Template2µL,RNaseFreeddH2O8.5µL,轻轻混匀。使用CFXconnectTM扩增仪扩增PCR。条件如下:95°C条件下预变性30秒,扩增40个周期,循环扩增的条件为95°C5秒,60°C30秒。通过检测荧光染料SYBRGreen的荧光强度,然后定量分析相应样品中的RNA量。

1.2.9免疫印迹法检测乳腺癌细胞中蛋白的表达

(1)乳腺癌细胞中总蛋白的提取

临用前,每10mL细胞裂解液中加入一支磷酸化的蛋白酶抑制剂,100mM的PMSF100µL,100mM的EDTA100µL,混合均匀,备用。

1)培养箱中取出处理后待提取细胞总蛋白的细胞,弃上清,冷PBS洗弃残余培养基后尽量将液体甩尽。

2)加入500µL的细胞裂解液,于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解,培养瓶在冰上来回移动。

3)在冰上用干净的细胞刮将瓶壁上的细胞刮下,吸取至1.5mL的EP管中。

4)冰上超声裂解3min,提前打开离心机预冷,在4°C,12000转/分钟的条件下离心5min,取出EP管并用枪头吸取蛋白上清备用。

(2)BCA法测定蛋白浓度

1)工作液的配制:先提前计算好所需工作液的量,按照A液:B液=50:1的比例配制工作液并在涡旋混匀器上混匀备用。

2)蛋白标准液浓度梯度的配制

先在8个干净的EP管中分别加入100µL蒸馏水,向第1个EP管中加入标准品BSA100µL,在涡旋混匀器上混合均匀后取100µL加入到第2管中,混合均匀,再吸出100µL加入到第3管中,以此类推,得到浓度梯度的蛋白标准液。

3)待测样品的稀释

将2.5µL细胞蛋白样品加入到装有97.5µL蒸馏水的EP管中,使得蛋白样品稀释40倍,涡旋混匀器上混合均匀。

4)加样

在酶标板内,将稀释好的样品或标准品各25µL加入到每孔中,每个样品或标准品都做三个复孔,再向每孔中加入200µL配制好的工作液,混匀。

5)蛋白浓度的测定

将加好样的酶标板在37°C的孵育箱中孵育30min,然后在酶标仪上570nm的波长处测其吸光度值,最后根据各标准品浓度得出来的标准曲线,计算出各个细胞样品的蛋白浓度。

(3)蛋白样品的变性与保存临用前,将b-巯基乙醇,按10%的比例加入到配制好的2×上样缓冲液中,混匀,将蛋白样品与上样缓冲液按1:1的比例加入到EP管中,混合均匀,用封口胶仔细封好EP管管口,在水浴锅中煮沸10min,使蛋白充分变性,室温冷却后,按每200µL变性后的蛋白样品量分装于干净的EP管中,封口胶仔细封好管口,保存于-20°C,备用于Westernblot实验分析。

(4)Westernblot实验方法

1)灌胶与上样

a)按表1各试剂的量先后制备分离胶和浓缩胶,12%分离胶是0.75mm的玻璃板制两块胶的用量

表1.分离胶和浓缩胶的配制

Tab1.Theconfigurationoftheseparationandenrichmentadhesive

12%分离胶4%浓缩胶

ddH2O3.3mL4.35mL

1.5MTris-HCl(PH=8.8)2.5mL

1.0MTris-HCl(PH=6.8)0.75mL

30%AA/Bis4mL0.81mL

10%SDS100µL60µL

10%AP100µL120µL

EMED4µL6µL

b)上样:根据样品的蛋白浓度按每孔40µg的量计算出所需上样的体积,然后上相应体积的细胞蛋白样品,蛋白Marker的上样量为3µL。

2)电泳

先在20mA恒流条件下电泳,等到显色剂溴酚蓝跑到分离胶处时(大约20-30min)更换为100V电压电泳。电泳至Marker跑至各条带距离适中时即可终止电泳。

3)转膜

电泳结束前配制转膜液,将蒸馏水450mL加入到配转膜液用的方盘中,再依次加入150mL5×转膜缓冲液和150mL甲醇,混合均匀,转膜前30min将硝酸纤维素膜浸泡在转膜液中,电泳结束后,在100V电压条件下转膜100min。

4)免疫反应

a)1×TBST的配制:将250µL的Tween-20加入到500mL的1×TBS中,混合均匀。

b)1%BSA封闭液的配制:将0.2gBSA加入到20mL1×TBST中,混合均匀。

c)封闭:将载有蛋白的硝酸纤维素膜转移到装有封闭液的培养皿中,置于摇床上缓缓摇动,室温封闭1h。

d)孵一抗:按抗体说明书中的条件用封闭液将一抗稀释到适宜浓度并将载有蛋白的硝酸纤维素膜用其孵育,4°C过夜。

e)孵二抗:用TBST室温洗膜3×5min,按抗体说明书中的条件将二抗用TBST稀释到适合的浓度,室温孵育1h。

f)显色及显影:在室温条件下,用TBST洗膜3×5min,将ECL显色工作液均匀铺在滴干的膜上,进行化学发光反应并显影。

1.2.10裸鼠干预及组织的处理

鉴于前期动物预实验发现,裸鼠0.5%CMC-Na溶媒组与空白对照组相比,CMC-Na的生物学效应并无统计学差异,因此我们后续裸鼠实验去除0.5%CMC-Na溶媒组。动物干预如图2所示,4-5周龄的雌性裸鼠随机分为4组,每组6只,包括空白对照组,木犀草素干预组,Ad-GFP+木犀草素组和Ad-b-catenin+木犀草素组。空白组和木犀草素干预组以皮下注射正常乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠原位乳腺癌模型,Ad-GFP+木犀草素组以皮下注射转染带GFP标记的空载病毒的乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠原位乳腺癌模型,Ad-b-catenin+木犀草素组以皮下注射转染带GFP的带目的基因b-catenin的病毒的乳腺癌细胞MDA-MB-231(1×106/只)建立裸鼠过表达b-catenin的原位乳腺癌模型。待原位肿瘤长至体积约1cm3(14天)后,木犀草素干预组,Ad-GFP+木犀草素组和Ad-b-catenin+木犀草素组按每次100mg/kg的剂量每三天腹腔注射中药单体木犀草素,空白对照组不做任何处理。8周后,用七氟烷使得裸鼠麻醉致死,眼科手术剪取下裸鼠的原位肿瘤组织。随后,再用眼科手术剪剖开裸鼠胸腔和腹腔,用生理盐水将肺组织中的血灌洗干净,取得裸鼠的完整肺组织,计数并记录裸鼠肺组织上的肿瘤结节数。然后用0.9%的生理盐水漂洗干净肿瘤组织和肺组织,滤纸上晾干。眼科手术剪分别将肿瘤组织和肺组织各分为4份,1份用4%多聚甲醛固定,室温保存,用于做石蜡切片;1份用4%多聚甲醛固定30min,15%蔗糖脱水12h,再30%蔗糖脱水12h,滤纸吸干水分,用OTC包埋于-80°C保存,用于做冰冻切片;另2份置于1.5mL的灭酶EP管中,-80°C保存。

1.2.11裸鼠肿瘤、肺组织石蜡切片及冰冻切片病理学分析

做石蜡切片的组织经过酒精分级脱水,石蜡包埋后,切成厚度约2-5µm的石蜡切片,用于做免疫组织化学实验和HE染色实验。做冰冻切片的组织从-80°C冰箱取出,于-20°C条件下平衡1h,切成厚度约8µm的冰冻切片,于-20°C保存备用于做免疫荧光组织化学实验。

(1)HE染色

组织切片先水化后,用苏木精和伊红染色,盐酸酒精分化,封片后在显微镜下观察并照相。

(2)免疫组织化学实验

1)石蜡切片置于切片架上,依次在下列试剂中浸泡使切片脱蜡水化:二甲苯2×5min,无水乙醇2×5min,95%乙醇2×5min,70%乙醇5min,50%乙醇5min,冷水梳洗。

2)用柠檬酸钠缓冲液热修复30min,自然冷却。

3)用10%山羊血清封闭组织切片30min。

4)TBS洗3×5min,孵育一抗,于湿盒中4°C过夜。

5)TBS洗3×5min,用含3%双氧水的甲醇浸泡20min,滴加生物素标记的二抗,室温孵育30min。

6)TBS洗3×5min,滴加1%卵白素和生物素化的酶,室温反应30min。

7)TBS洗3×5min,AEC或DAB显色反应15min。

8)TBS洗3×5min,苏木精染色2min。

9)TBS洗3×5min,水溶性封片剂封片,于正置显微镜下观察并拍照。

(3)免疫荧光组织化学实验

1)冰冻切片在4°C条件下用丙酮固定10min,室温自然晾干。

2)TBS洗3×5min,柠檬酸缓冲液抗原修复15min,室温自然冷却。

3)TBS洗3×5min,10%血清封闭1h。

4)37°C条件下孵育一抗(鼠抗Vimentin和兔抗Slug)2h。

5)TBS洗3×5min,室温孵育羊抗鼠二抗Dylight488和羊抗兔二抗Dylight55030min。

6)TBS洗3×5min,DAPI染核30min。

7)TBS洗3×5min,封片剂封片,于正置荧光显微镜下观察并拍照。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)