关键词:乙型肝炎病毒 小鼠模型 科进 Kirgen 卧宏生物 WHB 爱思进 Axygen 科晶 Crystalgen 肖特 SCHOTT

 

1.2.5ELISA法检测小鼠血清ALT,HBsAg和HBeAg

收集C57HBV转基因小鼠的血清,再分别使用相应检测试剂盒(上海科华)检测上清液和小鼠血清中ALT、HBsAg和HBeAg,具体实验方法如下:

(1)ELISA法检测小鼠血清ALT:

1)首先稀释血清样品(7倍)或细胞上清(未稀释),根据实验需要取出反应板,向每孔加入100μl的稀释后样品后贴上遮光膜置于37°C恒温孵箱孵育1小时;

2)取出反应板,弃孔内液体(不需洗涤)再在每孔内加入50μl的Biotinantibody工作液,轻振荡混匀后,贴上遮光膜后置于37°C恒温孵箱孵育1小时;

3)取出反应板,弃尽每孔液体,洗涤液清洗5次,每次清洗10s并尽量拍干孔内的液体,在每孔内加入50μl的HRP-avidin工作液,遮光膜遮光后置于37°C恒温孵箱孵育30min;取出反应板,弃尽每孔液体,洗涤液清洗5次后拍干。

4)向上述的每孔内加入50μl的TMBSubstrate,贴上遮光膜置于37°C恒温孵箱孵育15-30min,然后每孔内加入50μl的终止液,轻轻混匀后用酶标仪读取A450的数据。

(2)ELISA法检测小鼠血清HBsAg:

1)首先稀释血清,保留三个阴性对照、一个阳性对照和一空白对照,向检测板的每孔内加入45μl生理盐水+5μl样本。贴上遮光膜后在37°C恒温孵箱孵育1小时,不弃孔内液体,再向该反应板的每孔内加入50μl的酶反应液,轻轻混匀;贴上遮光膜后于37°C恒温孵箱孵育30min;

2)取出反应板,弃尽孔内液体,洗涤液清洗5次每次10s,清洗后拍干每孔内的液体,再在每孔内加入显色液A与B各50μl,贴上遮光膜后置于37°C恒温孵箱孵育15min;最后加入50μl的终止液终止反应,轻轻混匀后用酶标仪读取A450的数据。

(3)ELISA法检测小鼠血清HBeAg:

1)首先稀释血清,保留两个阴性对照、两个阳性对照和一空白对照,向检测板的每孔内加入40μl生理盐水+10μl样本,然后向该反应板的每孔内加入50μl的酶结合液,轻摇混匀;避光后于37°C孵箱孵育30min;

2)取出反应板,弃尽孔内液体,洗涤液洗涤5次后拍干,再在每孔内加入显色液A与B各50μl,避光置于37°C恒温孵箱孵育15min后,最后加入50μl的终止液终止反应,轻轻混匀后用酶标仪读取A450的数据。

1.2.6放射免疫法(IRMA)检测小鼠血清HBsAg和HBeAg

按照北京北方生物技术研究所放射免疫法检测试剂盒的说明书执行,实验前准备好检测试剂、检测样本(如血清)以及若干无菌的聚苯乙烯圆底试管。

(1)放射免疫法检测HBsAg:

1)相应反应管内加入200μl的待测样品和HBsAg标准品(需做重复管),再用无菌镊子在每管内加入1粒包被HBsAg的珠子,轻轻摇晃试管架清除珠子上可能的吸附气泡;

2)编码试管架并依次放回检测仪的试管槽内,进行第一步反应:在45℃条件下温育2小时,然后取出试管,枪头吸走试管内反应液,用5mlddH2O洗涤包被珠子(洗涤5次),最后将包被珠子置于滤纸上吸干液体;

3)相应试管内加入200μl的定量标记物溶液(125I-Anti-HBs),轻摇试管架去除珠子上可能的吸附气泡,45℃温育3个小时。取出试管后枪头吸走试管内反应液,然后用5mlddH2O洗涤包被珠(洗涤5次),最后将包被珠子置于滤纸上吸干液体;

4)最后一步用y-计数器测量珠子1分钟的CPM值,注:所有珠子的CPM值均应在24小时内测量,同时应对该测量仪本底进行5次测量,再取其平均值。

(2)放射免疫法检测HBeAg:

1)相应反应管内加入质控对照品(2管)、阳性对照品(2管)、阴性对照品(5管)、HBeAg标准品(2管)和200μl的待测样品,再用无菌镊子向每管内加入1粒包被HBeAg的珠子,轻轻摇晃试管架清除珠子上可能的吸附气泡;;

2)编码试管架并依次放回检测仪的试管槽内,进行第一步反应:在45℃条件下温育2小时,然后取出试管,枪头吸走试管内反应液,用5mlddH2O洗涤包被珠子(洗涤5次),最后将包被珠子置于滤纸上吸干液体;

3)相应试管内加入200μl的定量标记物溶液(125I-Anti-HBe),轻摇试管架去除珠子上可能的吸附气泡,45℃温育3个小时。取出试管后枪头吸走试管内反应液,然后用5mlddH2O洗涤包被珠(洗涤5次),最后将包被珠子置于滤纸上吸干液体;

4)最后一步用y-计数器测量珠子1分钟的CPM值,注:所有珠子的CPM值均应在24小时内测量,同时应对该测量仪本底进行5次测量,再取其平均值。

1.2.7IHC检测小鼠肝组织HBsAg和HBcAg

(1)石蜡组织切片制作方法:

1)标本取材及固定:选择实验小鼠,颈椎脱臼法处死后解剖游离肝脏,取组织指甲盖大小,将该组织块浸泡于4%的多聚甲醛5mL4℃固定7天;

2)送标本至重庆医科大学组织胚胎教研室切片。

(2)石蜡组织切片免疫组化染色方法:

1)将组织切片进行脱蜡:取出上述已烤干好(55°C恒温箱中烘烤2-4h)的组织切片放入二甲苯I液体内浸泡20min,然后再将其转移至二甲苯II液体内浸泡20min用以脱去组织切片中的蜡,然后再依次浸泡于无水乙醇、90%、80%和70%浓度的乙醇中各5min,最后取出该组织切片置于蒸馏水中浸泡5min;

2)柠檬酸盐抗原修复法(PH6.0):石蜡组织切片脱蜡后,将该组织切片放入含有枸橼酸盐缓冲液工作液的容器中,将该容器置于微波炉内80%火力加热2min30s,5min后加热15s(重复2次),使容器内液体的温度始终保持在95℃左右(15-20min),再取出该容器(不要取出组织切片)置于室温条件下自然冷却20min,待冷却后再用蒸馏水小心冲洗,再用无菌的PBS浸泡5min;

3)将其置于0.5%的TRITON溶液内常温浸泡20min,PBS小心冲洗2min(重复3次),然后将其置于3%的H2O2溶液内常温浸泡10min,PBS洗2min(重复3次)。

4)使用正常山羊血清(5~10%)对上述的石蜡组织切片进行封闭,室温条件下孵育1h(可延长封闭时间),小心倾掉血清(勿清洗),然后滴加稀释一抗或一抗工作液(Anti-HBs的稀释比例为1:100,Anti-HBc的稀释比例为1:200),将组织切片置于湿盒内4℃过夜。

5)取出组织切片,PBS冲洗5min×3,再滴加生物素标记二抗,再将已加入二抗的该组织切片置于湿盒内于37℃恒温孵箱或者常温孵育30min;

6)取出组织切片,PBS冲洗5min×3,然后滴加已用无菌的PBS按适当比例稀释好的辣根酶标记链霉卵白素,再将该组织切片置于湿盒内于37℃恒温孵箱或者常温孵育30min;

7)取出组织切片,PBS冲洗3min×3;DAB显色(不超过30s),然后再对已显色的石蜡组织切片用蒸馏水小心冲洗,最后再对该石蜡组织切片进行苏木素复染和封片镜检观察。

8)结果分析:选取片中染色均匀区域,每张切片至少选择10个视野(×400倍),观察片中细胞的着色强弱以及百分率。根据染色结果分析判断染色阳性信号第二部分HNF-4α、PG强弱:颗粒呈棕褐色(+++)、棕黄色(++)或者浅黄色(+)。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)