CXCR7对海马齿状回颗粒细胞树突棘与突触可塑性的调节作用

关键词：CXCR7 海马齿状回颗粒细胞树突棘 突触可塑性 科进 Kirgen  卧宏生物 WHB  爱思进 Axygen  科晶 Crystalgen  肖特 SCHOTT

1.4免疫荧光检测

（1）将冰冻切片置于室温10min，然后将其充分浸泡于丙酮20min，后将其取出，置于PBS中清洗（5min/次，共3次）；

（2）擦干切片周围的液体，通过0.4%TritonX-100进行破膜处理（37℃恒温箱，15min），用PBS清洗（5min/次，共3次）；

（3）擦干切片周围的液体，将切片充分浸入0.01mM柠檬酸修复液中，微波修复（高火3min，低火20min），自然冷却后置于PBS中清洗（5min/次，共3次）；

（4）擦干切片周围的液体，将山羊血清封闭液滴于组织上，后置于37℃恒温箱2小时进行封闭处理；

（5）甩掉血清，擦干切片周围的血清，均匀滴加一抗：CXCR7（1:50）+NeuN（1:100），CXCR7（1:50）+MAP2（1:200），CXCR7（1:50）；切片需保证平放于湿盒中，4℃环境中过夜孵育一抗；

（6）次日，将切片置于37℃恒温箱1小时（复温），然后用PBS清洗（10min/次，共3次），擦干切片周围的液体；以下所有步骤需要在避光条件下进行：

（7）均匀滴加荧光二抗（分别对应前述的一抗）：山羊抗兔AlexaFluor594（1:100）+山羊抗小鼠FITC（1:50），山羊抗兔AlexaFluor594（1:100）+山羊抗豚鼠AlexaFluor647（1:200），山羊抗兔AlexaFluor594。37℃恒温箱孵育1.5小时后取出，用PBS清洗（10min/次，共3次）；

（8）将DAPI染液均匀滴加于组织上，室温染色10min，后用PBS清洗（5min/次，共3次）；

（9）50%甘油封片，然后通过激光共聚焦显微镜成像，拍照后使用Image-ProPlus

6.0软件进行了数据分析。

1.5免疫印迹检测

1.5.1制备蛋白样品

（1）将脑组织从冻存管中取出，称重后将其置于无酶灭菌离心管中；

（2）将RIPA裂解液提前于室温中解冻，通过移液枪将适量RIPA蛋白裂解液（1ml/100mg）、蛋白酶抑制剂（1μl/100mg）、磷酸化酶抑制剂（1μl/100mg）加入有脑组织的离心管中；

（3）使用匀浆机将脑组织充分匀浆；

（4）将超速离心机进行预冷处理（4℃），将离心管置于低温超速离心机中进行超速离心（转速为12000rpm，共25min），离心管需要对称放置，拧紧内盖，注意安全；

（5）离心后，使用移液枪将上清液转移至新的无酶灭菌离心管中，转移过程中不要吸到底部的沉淀；

（6）按照BCA蛋白检测试剂盒说明书配置BCA工作液（A液比B液=50比1体积，振荡、混匀），将BCA工作液按照0、1、2、4、8、12、16和20μl体积依次加至96孔板中，然后，使用移液枪将相应体积的RIPA裂解液加至BCA工作液<20μl体积的孔中，补至20μl；

（7）将2μl体积的上清液加至96孔板中，然后使用移液枪将18μlRIPA裂解液加入孔中，同样补至20μl；

（8）将BCA工作液200μl加至各孔中，置于37℃恒温箱中30min后取出；

（9）自动酶标仪测定各孔吸光度：波长设定为562nm，Excel软件制作吸光度标准曲线，通过吸光度标准曲线计算蛋白浓度，使用RIPA裂解液进行蛋白样品配平（即蛋白浓度达到一致）；

（10）将5×SDS-PAGE的蛋白上样buffer按蛋白体积的1/4比例加入各管样品管中，振荡混匀后煮沸10min（蛋白变性）；

（11）蛋白样品冷却后于-80℃冰箱中保存。

1.5.3电转和封闭

（1）电转：将所切下的凝胶轻轻地转移至电转塑料夹，将提前剪好的PVDF膜盖至凝胶上，注意避免气泡，按顺序放置好后夹紧电转塑料夹。将电转塑料夹放进电转槽中，置于电转仪中，倒满电转液，连接电源，设置210mA恒流，于4℃环境下进行电转，电转时间根据检测蛋白分子量的不同控制在50-120min之间；

（2）电转结束后，将PVDF膜取出，然后使用镊子轻轻将其转移至含有5%脱脂奶粉封闭液的分格盒中，封闭2h。

1.5.4抗体孵育

（1）封闭完毕后，使用移液枪移除封闭液，将一抗（已用WB一抗二抗稀释液将其稀释：CXCR71:500，α-tubulin1:1000）均匀加入孵育槽中，4℃房间中孵育过夜；

（2）次日，将孵育盒取出，移除一抗，用预先配制好的TBST缓冲液洗PVDF膜

（置于脱色摇床，洗3次，每次5min）；

（3）移除TBST缓冲液，将山羊抗兔二抗（1:2000）均匀加入孵育槽中，孵育1小时（置于摇床上）后，使用TBST缓冲液洗PVDF膜（置于脱色摇床，洗3次，每次5min）；

1.5.5显影与数据处理

（1）按照ECL化学发光试剂盒说明书配制显影液，使用镊子将PDVF膜轻轻移至显影仪中，然后将显影液均匀滴至膜上，注意铺平及排除气泡，使用Fushion凝胶成像软件对其进行显影；

（2）采用QuantityOne4.6.2软件对显影结果进行图像处理与数据分析，测得每个条带的灰度值（intensityvalue），对每个条带的灰度值进行标准化。α-tubulin作为内参蛋白，CXCR7的相对表达量等于CXCR7的标准化灰度值除以内参的标准化灰度值。

1.6高尔基染色

（1）提前24小时，将试剂盒中1液与2液取出，按照说明书的比例，将1液、2液、ddH2O加入至离心管中制成1-2混合液，勿振荡，次日将上清液取出，移至另一个离心管中，不要吸到底部的杂质，每个标本需5倍体积以上的液体；

（2）将小鼠脑组织取出后，生理盐水冲洗，修整，充分暴露海马，将组织用镊子轻轻移至1-2混合溶液，充分浸入，用锡箔纸包好，室温避光保存；

（3）14天后，将脑组织移至新的离心管中，加入5倍体积以上的3液，脑组织需充分浸入，避光4℃保存，12小时后换液，再加入等量的3液，避光4℃保存1周；

（4）配制4、5液的混合液，然后准备无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、二甲苯待下一步使用；

（5）通过振荡切片机，慢速轻柔地将脑组织切成冠状位300µm的切片，将切片移至干净无菌的培养皿中，然后将提前配制好的4、5混合液加入培养皿中显色，将盛有切片的培养皿置于摇床上（避光，15min）；移除4、5混合液，小心、轻柔地将切片转移至防脱载玻片上，然后置于酒精中梯度脱水，再置于二甲苯中透明处理，最后使用中性树胶封片并避光保存；

（6）在普通光学显微镜下观察染色情况，在油镜下拍摄树突棘形态，使用Image-ProPlus6.0软件对所拍摄图片进行数据分析。

1.7透射电镜

（1）将脑组织标本从电镜专用固定液（固定24小时以上）中取出，用PBS漂洗标本（3次，每次15min），使用2%锇酸固定2小时后，再用PBS漂洗标本（3次，每次15min）；

（2）将标本放置于酒精中梯度脱水，在4℃环境下将标本置于90%的丙酮中浸泡20min，取出后再置于100%的丙酮中浸泡15min；

（3）将标本充分浸入丙酮加包埋液（2:1）的混合液中3小时，然后再将其充分浸入丙酮加包埋液（1:2）的混合液中12小时；然后将标本置于包埋液中3小时；

（4）包埋后分别依次将标本置于37℃恒温箱（12小时）、45℃恒温箱（12小时）、60℃恒温箱（24小时）；

（5）使用电镜专用超薄切片机切片（60nm），将切片置于柠檬酸溶液中（15min）。使用预先配制好的醋酸双氧铀染色液进行染色处理；

（6）使用投射电镜进行拍照后，使用Image-ProPlus6.0软件进行了图像处理与数据分析；

（7）本课题组需要对兴奋性突触进行计数，电镜下兴奋性突触（excitatorysynapse,ES）的鉴定标准[21]：1）主要位于树突棘；2）突触前后不对称，突触前膜比突触后膜薄；3）突触前膜内有圆而清亮突触囊泡（synapticvesicles,SVs）；4）突触后致密物（postsynapticdensity,PSD）面积较大，占突触后膜的比例大。此外，我们通过Image-ProPlus6.0软件对PSD的长度、厚度以及SVs的个数进行统计分析[22]。

实验所需耗材：