关键词:CXCR7 海马齿状回颗粒细胞树突棘 突触可塑性 科进 Kirgen  卧宏生物 WHB  爱思进 Axygen  科晶 Crystalgen  肖特 SCHOTT

 

1.4免疫荧光检测

(1)将冰冻切片置于室温10min,然后将其充分浸泡于丙酮20min,后将其取出,置于PBS中清洗(5min/次,共3次);

(2)擦干切片周围的液体,通过0.4%TritonX-100进行破膜处理(37℃恒温箱,15min),用PBS清洗(5min/次,共3次);

(3)擦干切片周围的液体,将切片充分浸入0.01mM柠檬酸修复液中,微波修复(高火3min,低火20min),自然冷却后置于PBS中清洗(5min/次,共3次);

(4)擦干切片周围的液体,将山羊血清封闭液滴于组织上,后置于37℃恒温箱2小时进行封闭处理;

(5)甩掉血清,擦干切片周围的血清,均匀滴加一抗:CXCR7(1:50)+NeuN(1:100),CXCR7(1:50)+MAP2(1:200),CXCR7(1:50);切片需保证平放于湿盒中,4℃环境中过夜孵育一抗;

(6)次日,将切片置于37℃恒温箱1小时(复温),然后用PBS清洗(10min/次,共3次),擦干切片周围的液体;以下所有步骤需要在避光条件下进行:

(7)均匀滴加荧光二抗(分别对应前述的一抗):山羊抗兔AlexaFluor594(1:100)+山羊抗小鼠FITC(1:50),山羊抗兔AlexaFluor594(1:100)+山羊抗豚鼠AlexaFluor647(1:200),山羊抗兔AlexaFluor594。37℃恒温箱孵育1.5小时后取出,用PBS清洗(10min/次,共3次);

(8)将DAPI染液均匀滴加于组织上,室温染色10min,后用PBS清洗(5min/次,共3次);

(9)50%甘油封片,然后通过激光共聚焦显微镜成像,拍照后使用Image-ProPlus

6.0软件进行了数据分析。

1.5免疫印迹检测

1.5.1制备蛋白样品

(1)将脑组织从冻存管中取出,称重后将其置于无酶灭菌离心管中;

(2)将RIPA裂解液提前于室温中解冻,通过移液枪将适量RIPA蛋白裂解液(1ml/100mg)、蛋白酶抑制剂(1μl/100mg)、磷酸化酶抑制剂(1μl/100mg)加入有脑组织的离心管中;

(3)使用匀浆机将脑组织充分匀浆;

(4)将超速离心机进行预冷处理(4℃),将离心管置于低温超速离心机中进行超速离心(转速为12000rpm,共25min),离心管需要对称放置,拧紧内盖,注意安全;

(5)离心后,使用移液枪将上清液转移至新的无酶灭菌离心管中,转移过程中不要吸到底部的沉淀;

(6)按照BCA蛋白检测试剂盒说明书配置BCA工作液(A液比B液=50比1体积,振荡、混匀),将BCA工作液按照0、1、2、4、8、12、16和20μl体积依次加至96孔板中,然后,使用移液枪将相应体积的RIPA裂解液加至BCA工作液<20μl体积的孔中,补至20μl;

(7)将2μl体积的上清液加至96孔板中,然后使用移液枪将18μlRIPA裂解液加入孔中,同样补至20μl;

(8)将BCA工作液200μl加至各孔中,置于37℃恒温箱中30min后取出;

(9)自动酶标仪测定各孔吸光度:波长设定为562nm,Excel软件制作吸光度标准曲线,通过吸光度标准曲线计算蛋白浓度,使用RIPA裂解液进行蛋白样品配平(即蛋白浓度达到一致);

(10)将5×SDS-PAGE的蛋白上样buffer按蛋白体积的1/4比例加入各管样品管中,振荡混匀后煮沸10min(蛋白变性);

(11)蛋白样品冷却后于-80℃冰箱中保存。

1.5.3电转和封闭

(1)电转:将所切下的凝胶轻轻地转移至电转塑料夹,将提前剪好的PVDF膜盖至凝胶上,注意避免气泡,按顺序放置好后夹紧电转塑料夹。将电转塑料夹放进电转槽中,置于电转仪中,倒满电转液,连接电源,设置210mA恒流,于4℃环境下进行电转,电转时间根据检测蛋白分子量的不同控制在50-120min之间;

(2)电转结束后,将PVDF膜取出,然后使用镊子轻轻将其转移至含有5%脱脂奶粉封闭液的分格盒中,封闭2h。

1.5.4抗体孵育

(1)封闭完毕后,使用移液枪移除封闭液,将一抗(已用WB一抗二抗稀释液将其稀释:CXCR71:500,α-tubulin1:1000)均匀加入孵育槽中,4℃房间中孵育过夜;

(2)次日,将孵育盒取出,移除一抗,用预先配制好的TBST缓冲液洗PVDF膜

(置于脱色摇床,洗3次,每次5min);

(3)移除TBST缓冲液,将山羊抗兔二抗(1:2000)均匀加入孵育槽中,孵育1小时(置于摇床上)后,使用TBST缓冲液洗PVDF膜(置于脱色摇床,洗3次,每次5min);

1.5.5显影与数据处理

(1)按照ECL化学发光试剂盒说明书配制显影液,使用镊子将PDVF膜轻轻移至显影仪中,然后将显影液均匀滴至膜上,注意铺平及排除气泡,使用Fushion凝胶成像软件对其进行显影;

(2)采用QuantityOne4.6.2软件对显影结果进行图像处理与数据分析,测得每个条带的灰度值(intensityvalue),对每个条带的灰度值进行标准化。α-tubulin作为内参蛋白,CXCR7的相对表达量等于CXCR7的标准化灰度值除以内参的标准化灰度值。

1.6高尔基染色

(1)提前24小时,将试剂盒中1液与2液取出,按照说明书的比例,将1液、2液、ddH2O加入至离心管中制成1-2混合液,勿振荡,次日将上清液取出,移至另一个离心管中,不要吸到底部的杂质,每个标本需5倍体积以上的液体;

(2)将小鼠脑组织取出后,生理盐水冲洗,修整,充分暴露海马,将组织用镊子轻轻移至1-2混合溶液,充分浸入,用锡箔纸包好,室温避光保存;

(3)14天后,将脑组织移至新的离心管中,加入5倍体积以上的3液,脑组织需充分浸入,避光4℃保存,12小时后换液,再加入等量的3液,避光4℃保存1周;

(4)配制4、5液的混合液,然后准备无水乙醇、95%乙醇、80%乙醇、75%乙醇、二甲苯待下一步使用;

(5)通过振荡切片机,慢速轻柔地将脑组织切成冠状位300µm的切片,将切片移至干净无菌的培养皿中,然后将提前配制好的4、5混合液加入培养皿中显色,将盛有切片的培养皿置于摇床上(避光,15min);移除4、5混合液,小心、轻柔地将切片转移至防脱载玻片上,然后置于酒精中梯度脱水,再置于二甲苯中透明处理,最后使用中性树胶封片并避光保存;

(6)在普通光学显微镜下观察染色情况,在油镜下拍摄树突棘形态,使用Image-ProPlus6.0软件对所拍摄图片进行数据分析。

1.7透射电镜

(1)将脑组织标本从电镜专用固定液(固定24小时以上)中取出,用PBS漂洗标本(3次,每次15min),使用2%锇酸固定2小时后,再用PBS漂洗标本(3次,每次15min);

(2)将标本放置于酒精中梯度脱水,在4℃环境下将标本置于90%的丙酮中浸泡20min,取出后再置于100%的丙酮中浸泡15min;

(3)将标本充分浸入丙酮加包埋液(2:1)的混合液中3小时,然后再将其充分浸入丙酮加包埋液(1:2)的混合液中12小时;然后将标本置于包埋液中3小时;

(4)包埋后分别依次将标本置于37℃恒温箱(12小时)、45℃恒温箱(12小时)、60℃恒温箱(24小时);

(5)使用电镜专用超薄切片机切片(60nm),将切片置于柠檬酸溶液中(15min)。使用预先配制好的醋酸双氧铀染色液进行染色处理;

(6)使用投射电镜进行拍照后,使用Image-ProPlus6.0软件进行了图像处理与数据分析;

(7)本课题组需要对兴奋性突触进行计数,电镜下兴奋性突触(excitatorysynapse,ES)的鉴定标准[21]:1)主要位于树突棘;2)突触前后不对称,突触前膜比突触后膜薄;3)突触前膜内有圆而清亮突触囊泡(synapticvesicles,SVs);4)突触后致密物(postsynapticdensity,PSD)面积较大,占突触后膜的比例大。此外,我们通过Image-ProPlus6.0软件对PSD的长度、厚度以及SVs的个数进行统计分析[22]。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)