关键词:高胆固醇 乌拉坦  小鼠肺癌 科进 Kirgen  卧宏生物 WHB  爱思进 Axygen  科晶 Crystalgen  肖特 SCHOTT

 

2.6免疫组织化学检测

2.6.1H&E染色

将肺组织切片标本用苏木素伊红染色(H&E),染色切片于光学显微镜下观察并照相。对每只小鼠肺组织切片肿瘤病变情况进行分析,包括非典型性增生、腺

2.2小鼠基本情况检查

瘤、腺癌,并记录其病变种类及个数。

2.6.2PCNA免疫组化检测

脱蜡1.将肺组织石蜡切片放于烤箱37℃,过夜;2.玻片放于二甲苯I,II,III分别10min;3.放入无水乙醇I,II分别5min;4.95%酒精I,II分别5min;5.70%酒精5min;6.PBSPH7.2洗5min;抗原修复将玻片放入含柠檬酸缓冲液PH6.0的抗原修复盒中,80%火力,微波修复,煮沸后加部分柠檬酸缓冲液,冷却10min再次煮沸,自然冷却,加ddH2O洗两次,后用PBS洗5min。染色1.3%H2O2孵育15min,以消除内源性过氧化物酶,之后用PBS洗5min*3次;2.滴加封闭液试剂A(正常山羊血清)室温孵育1h,倾去,勿洗;3.滴加PCNA抗体(山羊抗小鼠,稀释比例为1:100),4℃,过夜;4.PBS洗5min*3次;5.滴加试剂B(二抗兔抗山羊),室温孵育30min;6.PBS洗,5min*3次;7.滴加试剂C(辣根酶标记链酶卵白素),室温孵育30min;8.PBS洗,5min*3次;9.滴加DAB工作液(50ulDAB浓缩液加于1mlDAB底物缓冲液中),在显微镜下观察直至有棕色颗粒出现时即终止显色,用自来水充分冲洗;10.苏木素染色,1min左右,自来水充分冲洗;脱水,透明,封片1.70%酒精蘸10次;2.95%酒精I,II分别蘸10次;3.无水乙醇I,II,III分别蘸10次;4.二甲苯I,II,III分别蘸10-15次;5.滴一滴中性树胶,小心用盖玻片封片,避免气泡;显微镜下观察、照相、定量对PCNA阳性细胞的定量:取每组小鼠切片3-4张,对每张肺组织切片4个不同镜头区域的细胞进行观察计数,每个区域计数100个细胞,取其4个区域阳性细胞平均数为阳性比例。

2.7支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及细胞因子的检测

取三次离心所得细胞沉淀重悬于1mlPBS中,使用网格计数法于显微镜下进行计数得到BALF中细胞总数。应用美国Raybiotech公司抗体芯片技术检测BALF中40中炎症因子的含量,并用BALF中蛋白量进行标化。

2.8蛋白质的提取及westernblot分析

2.8.1胞浆胞核蛋白提取

1.取一叶肺组织样本,将组织研磨成浆,加入400ul预冷的BufferA(使用前每mlBufferA加入1ulDTT,5ul100mMPMSF,1ul蛋白酶抑制剂;即400ulBufferA加入0.4ulDTT,2ulPMSF,0.4ul蛋白酶抑制剂),大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上10-15min;2.加入22ul预冷的BufferB,大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min,4℃,16000g,5min;3.尽快将上清液转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞浆蛋白;

4.在离心沉淀物中加入200ulBufferC(使用前每mlBufferC加入1ulDTT,5ul100mMPMSF,1ul蛋白酶抑制剂;即200ulBufferC加入0.2ulDTT,1ulPMSF,0.2ul蛋白酶抑制剂),大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10min涡旋剧烈振荡15s;5.4℃离心,16000g,10min,尽快将上清转入预冷的洁净离心管,即得核蛋白;6.用BCA法测定胞浆及胞核蛋白浓度,以低浓度进行标化,分装并保存于-80℃2.8.2全蛋白提取

1.配制Buffer,按照1mlLysisBuffer加入5ul磷酸酶抑制剂,1ul蛋白酶抑制剂,5ul100mMPMSF比例配制;2.取一叶肺组织研磨成浆,加入500ul预冷了的LysisBuffer;3.将组织浆转移至预冷的离心管中,离心,10000rpm/min,4℃,5min;4.吸取上清转移至新的预冷离心管中,即为全蛋白提取物;5.用BCA法测定蛋白浓度,以低浓度进行标化成统一浓度,分装并保存于-80℃。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)