高胆固醇饮食对乌拉坦诱导的C57BL/6J小鼠肺癌发生发展的影响及其机制研究

关键词：高胆固醇 乌拉坦  小鼠肺癌 科进 Kirgen  卧宏生物 WHB  爱思进 Axygen  科晶 Crystalgen  肖特 SCHOTT

2.6免疫组织化学检测

2.6.1H&E染色

将肺组织切片标本用苏木素伊红染色（H&E），染色切片于光学显微镜下观察并照相。对每只小鼠肺组织切片肿瘤病变情况进行分析，包括非典型性增生、腺

2.2小鼠基本情况检查

瘤、腺癌，并记录其病变种类及个数。

2.6.2PCNA免疫组化检测

脱蜡1.将肺组织石蜡切片放于烤箱37℃，过夜；2.玻片放于二甲苯I,II,III分别10min；3.放入无水乙醇I,II分别5min；4.95%酒精I,II分别5min；5.70%酒精5min；6.PBSPH7.2洗5min；抗原修复将玻片放入含柠檬酸缓冲液PH6.0的抗原修复盒中，80%火力，微波修复，煮沸后加部分柠檬酸缓冲液，冷却10min再次煮沸，自然冷却，加ddH2O洗两次，后用PBS洗5min。染色1.3%H2O2孵育15min，以消除内源性过氧化物酶，之后用PBS洗5min*3次；2.滴加封闭液试剂A（正常山羊血清）室温孵育1h，倾去，勿洗；3.滴加PCNA抗体（山羊抗小鼠，稀释比例为1:100），4℃，过夜；4.PBS洗5min*3次；5.滴加试剂B（二抗兔抗山羊），室温孵育30min；6.PBS洗，5min*3次；7.滴加试剂C（辣根酶标记链酶卵白素），室温孵育30min；8.PBS洗，5min*3次；9.滴加DAB工作液（50ulDAB浓缩液加于1mlDAB底物缓冲液中），在显微镜下观察直至有棕色颗粒出现时即终止显色，用自来水充分冲洗；10.苏木素染色，1min左右，自来水充分冲洗；脱水，透明，封片1.70％酒精蘸10次；2.95％酒精I,II分别蘸10次；3.无水乙醇I，II，III分别蘸10次；4.二甲苯I，II，III分别蘸10-15次；5.滴一滴中性树胶，小心用盖玻片封片，避免气泡；显微镜下观察、照相、定量对PCNA阳性细胞的定量：取每组小鼠切片3-4张，对每张肺组织切片4个不同镜头区域的细胞进行观察计数，每个区域计数100个细胞，取其4个区域阳性细胞平均数为阳性比例。

2.7支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞计数及细胞因子的检测

取三次离心所得细胞沉淀重悬于1mlPBS中，使用网格计数法于显微镜下进行计数得到BALF中细胞总数。应用美国Raybiotech公司抗体芯片技术检测BALF中40中炎症因子的含量，并用BALF中蛋白量进行标化。

2.8蛋白质的提取及westernblot分析

2.8.1胞浆胞核蛋白提取

1.取一叶肺组织样本，将组织研磨成浆，加入400ul预冷的BufferA(使用前每mlBufferA加入1ulDTT,5ul100mMPMSF,1ul蛋白酶抑制剂；即400ulBufferA加入0.4ulDTT,2ulPMSF,0.4ul蛋白酶抑制剂)，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上10-15min；2.加入22ul预冷的BufferB，大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min，4℃，16000g，5min；3.尽快将上清液转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白；

4.在离心沉淀物中加入200ulBufferC(使用前每mlBufferC加入1ulDTT,5ul100mMPMSF,1ul蛋白酶抑制剂；即200ulBufferC加入0.2ulDTT,1ulPMSF，0.2ul蛋白酶抑制剂)，大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15s；5.4℃离心，16000g，10min，尽快将上清转入预冷的洁净离心管，即得核蛋白；6.用BCA法测定胞浆及胞核蛋白浓度，以低浓度进行标化，分装并保存于-80℃2.8.2全蛋白提取

1.配制Buffer，按照1mlLysisBuffer加入5ul磷酸酶抑制剂，1ul蛋白酶抑制剂，5ul100mMPMSF比例配制；2.取一叶肺组织研磨成浆，加入500ul预冷了的LysisBuffer；3.将组织浆转移至预冷的离心管中，离心，10000rpm/min，4℃，5min；4.吸取上清转移至新的预冷离心管中，即为全蛋白提取物；5.用BCA法测定蛋白浓度，以低浓度进行标化成统一浓度，分装并保存于-80℃。

实验所需耗材：