关键词:日本血吸虫  疫苗 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2方法

1.2.1Sj26GST抗原编码基因的扩增、纯化、鉴定及序列测定

(1)引物设计据GenBank中Sj26基因序列设计一对引物,分别在上、下游引物的5’端加入BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点,上游引物(P1):

5‘-GCGGATCCATGTCCCCTATACTAGGTTAT-3’;下游引物(P2):5‘-TAGAATTCTTACAATCGTTTGTAATTCCG-3’,引物由上海生工合成。(2)模板的制备家兔感染Sj尾蚴42d后剖杀,经门静脉灌注法收集Sj成虫,在超声粉碎后的裂解液中加入乙醇,再将裂解液滴加到RNeasy硅胶膜上,RNA与硅胶膜结合,有效洗涤去除其他污染物,将浓缩RNA洗脱到无RNA酶的水中,得到成虫总RNA。(3)Sj26GST抗原编码基因的扩增以提取到的Sj成虫总RNA为模板,以P1、P2为引物,RT-PCR扩增Sj26GST基因片段。反应体系:2×RT-PCRMaster25μl,P1、P2各5μl,Sj263μl,RT/Taqmix1μl,双蒸水11μl,共50μl。反应条件:42℃60min,96℃4min,94℃1min,56℃1min,72℃2min,35个循环;72℃10min。(4)目的基因的纯化、鉴定及序列测定按照SK1142UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒说明书,对RT-PCR产物进行纯化,取3μl纯化产物,12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。以P1、P2为测序引物,对RT-PCR产物进行测序,由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

1.2.2大肠埃希菌-双歧杆菌穿梭表达载体(pGEX-1λT)的制备

取本室保存的重组菌BL21(pGEX-1λT)300μl,将其加入含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中,37220r/min℃厌氧培养24~72h。然后取过夜培养的上述菌液1~2ml,pGEX-1λT质粒的提取按UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒的说明书进行,产物用12g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3重组质粒pGEX-Sj26GST的构建及鉴定

(1)目的基因及载体的双酶切分别用BamHⅠ和EcoRⅠ对目的基因Sj26GST的RT-PCR扩增产物和载体pGEX-1λT进行双酶切。酶切体系:双蒸水9.4μl,10×TangoBuffer6μl,pGEX-1λT或RT-PCR产物42μl,BamHⅠ、EcoRⅠ各1.3μl,总体积均为60μl。将上述物质混匀,5000r/min离心15S,置37℃水浴2h。按照UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒的说明书对酶切产物进行纯化。(2)目的基因与载体的连接酶切后载体与目的基因按约1:3的摩尔比例混合,连接反应按T4DNA连接酶的说明书进行。连接体系:Sj26GST为4μl,pGEX-1λT为12μl,10×T4Buffer为2μl,T4DNA连接酶为2μl,总体积20μl。同上离心,4℃过夜,再置于70℃水浴10min灭活T4DNA连接酶。(3)连接产物的鉴定将目的基因与载体连接后电穿孔转化感受态E.coli,于37℃、150r/min的摇床上培养1h后接种,37℃厌氧培养48~72h。挑取筛选琼脂平板上单个菌落至含AMP的LB培养液中,37℃,250r/min振荡培养48~72h后,提取重组质粒进行双酶切鉴定。

1.2.4重组Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建及鉴定

(1)感受态Bb的制备吸取1ml的两歧双歧杆菌(Bb)菌种接种于100ml含0.5mol/L蔗糖的MRS培养液中,制成感受态Bb菌液。(2)重组Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的构建将80μl感受态Bb和20μl重组质粒混匀冰浴lmin后,转移至电穿孔杯中进行电转化。转化后的菌液在电穿孔杯中停留5min后,加入MRS培养液混匀,转移至10ml培养管中,厌氧培养2h。吸取培养后的菌液0.1ml涂布于含AMP的MRS琼脂平板上,37℃厌氧培养72h。(3)重组Bb(pGEX-Sj26GST)疫苗的鉴定从上述MRS琼脂平板中挑取单个Bb菌落,加入100ml含蔗糖(0.5mol/L)的MRS培养液,厌氧培养7~10d。用质粒抽提试剂盒提取质粒,以重组pGEX-Sj26GST为模板,对重组质粒进行PCR反应。取3μlPCR产物,用12g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)