关键词:GIGYF2 糖尿病脑病 小鼠 认知功能障碍 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.4实时荧光定量PCR(Realtime-PCR)

  于无菌操作台上将收集的海马组织放入玻璃匀浆管中,加入RNA提取液(RNAisoPlus)和少许液氮充分研磨,照厂家提供的说明书方案,萃取组织标本总RNA。其浓度和纯度由NanoDrop2000c进行测定,选取A260/280曲线峰值位于1.8~2.0之间的RNA进行后续实验。使用PrimeScriptRT试剂盒进行RNA逆转录反应,反应液在0.5ml的无核酶PCR八排管中配置:5倍的缓冲液(5×PrimeScriptBuffer)2μl,逆转录酶(PrimeEnzymeMixI)0.5μl,寡核苷酸(Oligo(dT)Primer)(50μM)0.5μl,6核苷酸随机引物(Rondom6mers)0.5μl,模板(TotalRNA)500ng,并用无核酶水(RNaseFreeH2O)定容至10μl。而后将混合反应液放入PCR仪行逆转录反应,反应条件为:3715℃min,855℃sec。反应结束后,上述反应所得的总cDNA液置于冰上冷却。实时荧光定量PCR反应的引物由上海生工生物技术有限公司设计并合成。GIGYF2基因的引物序列为上游引物:5′-CTGTCGCCTCCTGTTCCTACT-3′;下游引物:5′-CTCTTCATCATCTGGCTCTGTG-3′。选取β-actin为内参基因,上游引物:5′-GTCCCTCACCCTCCCAAAAG-3′;下游引物:5′-GCTGCCTCAACACCTCAACCC-3′。实时荧光定量PCR反应的样品在避光环境下配置,每个样品同时配比两个副孔,取平均值作为终数值。反应体系:SYBRPremixExTaqTMII10μl,上游引物0.8μl,下游引物0.8μl,cDNA模板200ng,无核酶水定容至20μl。反应条件:953℃min;955℃sec,5830℃sec,7230℃sec行40个循环。融化过程中进行荧光定量,目的基因和内参基因的比较阈值周期(Ct值)由Bio-RadCFXManager软件(Bio-Rad,Hercules,CA)分析得出。目的基因的表达水平由与2-ΔΔCt计算方程获得。

1.2.5免疫印迹实验(WesternBlot)

  临用前加入适量苯甲基磺酰氟(PMSF,终浓度1mM)于RIPA裂解液中,按每20mg组织加150~250μl的比例加入预先配置的裂解液,于冰上在匀浆管中充分研磨并裂解组织蛋白。混合裂解液移至离心管中于低温离心机上离心10min(4℃,12000rpm),取上清液用二喹啉甲酸(BCA)试剂盒测定总蛋白浓度。蛋白液中加入适量5×十二烷基硫酸钠(SDS)上样液后于沸水中煮5min使蛋白质充分变性。选取β-actin作为内参蛋白,每组总蛋白量50μg,经10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离后,电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用5%脱脂牛奶(脱脂奶粉溶于Tween-20-Tris-bufferedsaline,TBST)封闭PVDF膜上的非特异性蛋白结合末端60min(37℃),再将PVDF膜分别置于不同一抗稀释液(GIGYF2多克隆抗体1:150;β-actin单克隆抗体1:3500)中4℃条件下过夜孵育。经TBST充分洗涤后,37℃条件下将PVDF膜孵育于由辣根过氧化物酶标记的二抗稀释液中60min。洗膜后,在暗室中使PVDF膜与ECL超敏工作液作用后,于凝胶成像仪下曝光显影。使用凝胶图像分析软件—Quantityone分析目的条带和相应内参条带,两者的半定量灰度值比值可用于目的蛋白的相对浓度定量。

1.2.6苏木精—伊红染色(HE染色)

  将石蜡包埋的组织以冠状位固定后行连续切片(5μm),将含有海马组织的切片粘贴到经APES处理过的载玻片上并置于60~65℃烤箱中烤片30~60min。切片脱蜡除水:切片依次放入二甲苯Ⅰ溶液15min→二甲苯Ⅱ溶液15min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→90%乙醇5min→80%乙醇5min→70%乙醇5min以除去二甲苯→蒸馏水冲洗5min以除去残留的乙醇。再用苏木精染液浸染切片10~15min后流水轻轻冲洗玻片上多余染液,5%盐酸乙醇分化,数秒后流水冲洗3~5min,伊红染液浸染5min后流水冲洗多余染液。而后用梯度酒精使切片脱水:70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→95%乙醇→100%乙醇各浸泡5min。二甲苯浸泡10min,使标本透明后滴加适量中性树胶并加盖盖玻片进行封片。切片干燥后可于光学显微镜下观察海马组织病理改变。

1.2.7免疫组织化学染色

  免疫组化染色使用生物素复合物(SABC)法,参照免疫组化试剂商提供的说明进行实验。主要操作过程如下:1.干净载玻片浸泡于含有APES的丙酮溶液中约30sec,晾干后放入100%丙酮溶液中除去未结合的APES,洗两次后晾干;2.石蜡组织连续切片(5μm),将含有海马组织的切片粘贴到经APES处理后的载玻片上,置于37℃的恒温箱中,过夜孵育;3.二甲苯脱蜡,梯度酒精水化;4.PBS洗两次,每次5min;5.用3%过氧化氢溶液于室温封闭切片5~10min以抑制内源性过氧化物酶的活性,随后蒸馏水清洗3次,每次2min;6.热修复抗原:切片浸泡于0.01M的枸橼酸盐缓冲液(PH6.0~6.3),微波炉内加热行热修复抗原。待抗原修复和自然冷却后,用PBS洗涤2次;7.封闭:滴加5%正常山羊血清封闭液,37℃封闭20min,轻甩去多余液体;8.滴加一抗稀释液(兔抗GIGYF2抗体,1:150,Santa),4℃过夜孵育,第二天复温1小时后PBS清洗3次,每次3min;9.滴加生物素标记的山羊抗兔二抗,37℃孵育60min,用PBS淋洗3次,每次3min;10.滴加抗生物素抗体(SABC),37℃孵育30min,PBS淋洗3次,每次5min;11.DAB显色:取1ml蒸馏水,与DAB显色试剂盒中的试剂各一滴混匀,加至切片上显色。于显微镜下观察显色程度,控制显色时间;12.蒸馏水洗净,滴加苏木精复染2min;13.梯度酒精脱水,后用二甲苯使切片透明,中性树脂封片;14.显微镜下观察棕黄色颗粒分布情况。注意匹配各样本海马组织解剖平面,使用OLYMPUSPM20自动显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)采集图片,并用Image-ProPlus5.1软件分析图像,取光密度(IOD)值为主要指标。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)