关键词:NaHS APP PS1 双转基因 小鼠 线粒体分裂融合 认知功能 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.3免疫组化法检测野生小鼠及转基因小鼠海马Drp1表达水平变化

小鼠脑组织石蜡标本的制作

1.灌流固定步骤同电镜取材

2.取脑:常规开颅取脑,用刀片切去小脑脑干部分,4%多聚甲醛固定6h。

3.制作石蜡切片

石蜡常规包埋用2.5%戊二醛+4%多聚甲醛固定好的标本,后进行连续切片,冠状面取含皮质和海马结构的脑切片,切片厚度为5μm,每例共取10片,放在60℃烤箱内烘烤4-5h,使切片组织透明。

4.免疫组化染色

1)二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ依次浸泡15分钟进行脱蜡,(100%、95%、85%、70%、50%)梯度酒精依次浸泡1分钟进行水化,水化完成后用PBS清洗3次,每次5分钟。

2)每张切片上滴加0.5%的TritonX-100,37℃恒温孵箱孵育20分钟进行透膜处理。PBS洗3次,每次5分钟。

3)3%H2O2溶液37℃恒温孵箱孵育5-10分钟,用以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次,每次5分钟。

4)用95℃的0.01M枸橼酸钠浸泡10-15分钟进一步暴露抗原,自然冷却至室温,PBS冲洗3次,每次5分钟。

5)滴加10%山羊血清封闭液,室温反应20分钟。甩去多余液体,不洗。

6)滴加人抗小鼠Drp1一抗,浓度1:200,4℃孵育过夜。

7)滴加适量二抗(山羊抗人:检测Drp1),20-37℃孵育20分钟,PBS洗3次,每次5分钟。

8)滴加试剂C,20-37℃孵育20分钟。用PBS液清洗4次,每次洗涤时间5分钟。

9)DAB显色:现配DAB显色液,滴加适量在组织上,反应2~5分钟。

10)苏木素复染。脱水,透明,封片。

11)显微镜下观察。

设置空白对照,用PBS代替一抗对照染色以除外假阳性结果。

1.2.4QRT-PCR检测各组小鼠Drp1mRNA表达水平变化

(1)组织总RNA的提取

1)匀浆:取出标本加入Trizol。50mg组织Trizol用量1ml。

2)室温条件下反应5分钟,每管加入氯仿0.2ml,盖紧管盖,振荡器震摇20秒,充分混匀后,室温静置5分钟,之后放入4℃低温离心机中12,000rpm离心15分钟。

3)用移液器吸取最上层的透明液体到新的EP管中,切忌吸到中间层的白色沉淀。

4)每管加入0.5ml异丙醇,反复震荡混匀,在冰上反应10分钟,之后放入4℃离心机中,12,000rpm,离心10分钟。管底的白色沉淀物即为RNA。

5)每管加入1ml用DEPC水配置为终浓度75%的乙醇溶液,混匀后放入4℃离心机中,7,500rpm,离心5分钟。倒掉上清液。

6)室温放置30分钟使RNA自然风干,再加入20μl的DEPC水使RNA再次溶解。-80℃超低温冰箱冷藏。

(2)RNA浓度测定:方法步骤同第一部分1.1.2.5;

(3)逆转录:方法步骤同第一部分1.1.2.5;

(4)PCR反应:运用2-ΔΔCt方法确定目的基因表达的相对水平,内参对照为β-actin。待测基因的引物序列同第一部分1.1.2.5。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)