关键词:NaHS N2a细胞 线粒体分裂融合 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2方法

1.2.1细胞培养

(1)培养条件

N2a细胞株培养于DMEM培养基,加入10%胎牛血清以及2%的双抗(青霉素/链霉素),细胞孵箱条件:37℃,5%CO2,饱和湿度。取对数期细胞进行实验。

(2)细胞冻存

细胞长满瓶底时,倒掉原有培养液,用PBS清洗2遍,加入1ml0.25%胰蛋白酶放入孵箱中1分钟消化细胞,轻轻拍打瓶壁,使细胞完全脱落,加入等量新鲜培养基中和胰酶,倒入灭菌12ml离心管中,1000rpm离心5分钟,倒净培养液,注意不要倒掉管底沉淀,加入1ml冻存液,用巴氏管吹打50次左右吸入冻存管,4℃40min,-20℃40min,-80℃超低温冰箱长期保存。

(3)细胞复苏

取出冻存管,37℃水浴快速解冻转入灭菌离心管中,加入4-6ml新鲜培养基悬浮细胞,1000rpm离心5分钟,倒掉培养基,重新加入2-4ml新鲜培养基重悬,移至培养瓶中。

(4)细胞传代

细胞长满瓶底时可进行传代处理,倒掉原有培养基,PBS液洗两次,洗时可轻轻拍打瓶壁,拍掉死细胞,尽量洗净原有培养液,加入1ml胰酶,放入孵箱内1min,取出轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞完全脱落,在瓶口喷酒精消毒后转入超净台继续操作,置于酒精灯上再次消毒,打开瓶盖,加入等量胰酶中和,之后将培养瓶中全部液体倒入无菌离心管,1000rpm离心5分钟,再次进入超净台中,打开盖子,小心倒掉培养液,加入2ml培养液,轻轻敲打离心管使细胞散开,再加入2ml培养液,混匀,取2个新培养瓶,每瓶加入2ml,8字摇匀10次,置于孵箱继续培养。

1.2.2透射电镜检测NaHS对线粒体形态学变化的影响

(1)电镜标本取材1)取对数生长期的N2a细胞,接种于6孔板,密度2×105个细胞/孔。每孔加2ml培养液。

2)次日孔板中细胞融合度达到70%后,实验一加入NaHS终浓度为0μM,100μM,200μM,400μM的培养液,放入孵箱继续培养16小时,实验二加入终浓度为400μM的NaHS放入孵箱分别孵育8小时,16小时。

3)在超净台内倒掉原培养液,用巴氏管加入2mlPBS清洗两次,每次1分钟。

4)常规胰酶消化,中和后转移至EP管中离心5分钟,1000rpm.

5)弃去上清,每个EP管中用注射器沿EP管管壁轻轻加入1mlD-Hanks液清洗两次。

6)再次离心:4℃离心2000rpm,l0min。

7)倒掉D-Hanks液,用注射器沿EP管管壁吸净残余液体,并加入1ml2.5%电镜专用戊二酸溶液,4℃固定2h。

8)尽快送至生科院电镜室预约检测。

(2)线粒体分裂融合判定:线粒体长/宽≥2判定为融合状态的线粒体,称为“伸长的线粒体”(elongatedmitochondria),线粒体长/宽<2判定为分裂状态的线粒体,称为“球形线粒体”(roundmitochondria),线粒体数目取各组总线粒体数目的均值,n=5。

1.2.3MTT法检测细胞活力

(1)取对数生长期的细胞,胰酶消化后加入新鲜培养基重悬。

(2)按3×103/孔的密度接种96孔板。每组细胞设6个复孔,加入200ul培养基,只加培养基为空白对照。

(3)次日用移液器吸净原培养液,在各组中分别加入NaHS终浓度为0μM,100μM,200μM,400μM,600μM的培养液继续培养16h,取出孔板,每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl后,重新放进孵箱内培养4h,用移液器小心洗掉培养液,将DMSO150μl加入,置于摇床上匀速摇晃10分钟。

(4)空白对照孔(只加培养基)调零,用酶标仪测各孔吸光度(570nm)。

(5)计算每组吸光度值(OD)的平均值,以时间为横坐标,OD值为纵坐标,绘制生长曲线。

1.2.4ATP检测试剂盒检测细胞线粒体ATP产量

(1)用处于对数期的N2a细胞接种在6孔板中,细胞密度2×105/孔。每孔加2ml培养液。

(2)次日细胞融合度达到70%后,加入NaHS终浓度为0μM,100μM,200μM,400μM,600μM的培养液,放入孵箱继续培养16小时。

(3)样品准备:吸净培养液,每孔加入200μl裂解液并用移液器吹打5-10次至细胞完全液裂解,在4ºC低温离心机中以12000g速度离心5分钟,取上清。

(4)标准曲线测定的准备:将待用试剂在冰上溶解,用ATP检测裂解液将ATP标准溶液稀释为0.01、0.03、0.1、0.3、1、3和10μM。

(5)ATP检测工作液的配制:用ATP检测试剂稀释液按照1:9的比例稀释ATP检测试剂即为ATP检测工作液,置于冰上待用。

(6)ATP浓度的测定:每个检测孔加入100微升ATP检测工作液。室温放置3-5分钟,再加入20μl样品或标准品,用移液器迅速混匀,2秒后用luminometer测定RLU值。

(7)根据标准曲线计算出样品中ATP的浓度。

1.2.5QuantitativeReal-TimePCR检测Drp1mRNA的表达

(1)提取细胞RNA详细步骤

1)细胞裂解:吸尽培养液,将Trizol加入六孔板,每孔约1ml。移液枪吹打4-5次,待完全裂解后,用巴氏管吸入EP管中。

2)室温条件下反应5分钟,每管加入氯仿0.2ml,盖紧管盖,振荡器震摇20秒,充分混匀后,室温静置5分钟,之后放入4℃低温离心机中12,000rpm离心15分钟。

3)用移液器吸取最上边的透明液体到新的EP管中,切忌吸到中间层的白色沉淀。

4)每管加入0.5ml异丙醇,反复震荡混匀,在冰上反应10分钟,之后放入4℃离心机中,12,000rpm,离心10分钟。管底的白色沉淀物即为RNA。

5)每管加入1ml用DEPC水配置为终浓度75%的乙醇溶液,混匀后放入4℃离心机中7,500rpm离心5分钟,倒掉上清液,管底为RNA。

6)室温放置30分钟使RNA自然风干,再加入20μl的DEPC水使RNA再次溶解。-80℃超低温冰箱冷藏。

注意事项:RNA提取过程必须在RNA提取专用超净台中进行,全程必须戴口罩,乳胶手套,所用所有器械耗材均必须经过灭菌,灭酶处理,耐高温的金属器械可放在铝制饭盒中用烤箱高温灭酶,不耐高温的器械及耗材可购买已经灭酶处理的种类(EP管,枪头等)。

(2)用紫外分光光度计直接测定RNA浓度,1.8<OD260nm/OD280nm<2.0则纯度符合要求。

3)cDNA的合成:应用TAKARA公司PrimeScript®RTreagentKit试剂盒20μl逆转录体系操作步骤将RNA逆转录成cDNA,具体反应体系如下:

5×PrimeScript®Buffer4μl

PrimeScript®RTEnzymeMix1μl

OligodTPrimer1μl

Random6mers1μl

TotalRNA0.8μg

RNaseFreedH2O12.2μl

RT条件:

37℃15min

85℃5s

将第一步已测好浓度的RNA放入PCR仪中,按上述体系完成反应得到cDNA。

(3)PCR反应:应用TAKARA公司SYBR®PremixExTaqTMⅡ试剂盒25μl反应

体系操作步骤进行,具体反应体系如下:

试剂使用量

SYBR®PremixExTaqTMⅡ12.5μl

PCR上游引物1μl

PCR下游引物1μl

cDNA2μl

dH2O8.5μl

反应条件:

循环数步骤温度时间

1预变性95℃30s

40PCR反应95℃5s

60℃30s

PCR反应结束后,进行1个循环(65℃5s,95℃5min)熔解曲线反应以检测扩增的特异性。每次检测设立3个复孔,至少重复3次。运用2-ΔΔCt方法确定目的基因表达的相对水平,内参对照为β-actin。

待测基因的引物序列由上海生工合成,序列如下所示:

基因引物序列

Drp1F:5’-GGCATTACAAGGAGCCAGTC-3’

R:5’-CAGCAGGTTCAAGTCAGCAA-3’

β-actinF:5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’

R:5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’

1.2.6Westernblot方法检测Drp1蛋白的表达

(1)细胞总蛋白的提取

1)倒掉培养液,用PBS缓冲液轻轻清洗两遍,移液枪吸净残留PBS。

2)从冰箱中取出蛋白裂解液及PMSF,室温解冻,先配置蛋白裂解液与PMSF的混合溶液(按照碧云天公司提供的使用说明书配置),之后将6孔板置于冰上打开盖子,每孔加入100μl的配好的混合溶液,用枪头反复吹打使裂解液与细胞充分接触,之后冰上反应30分钟。

3)反应完成后,用细胞刮将孔板中的细胞裂解产物收集至EP管中,做好标记。

4)置于4℃低温离心机离心10分钟,12500rpm,用1ml注射器小心沿管壁吸取上清液转移至新的EP管中,做好标记。

5)从冰箱中取出上样缓冲液,室温解冻后按照1:4的比例,加入提取的细胞蛋白中,在沸水中煮5分钟,-20℃冷藏。

(2)蛋白浓度测定

使用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。操作按照生产厂家说明书进行。

(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳及转膜过程如下:

1)安装配胶用的胶槽。

2)配胶:

①分离胶:根据目的分子量的大小,配制10%或12%的分离胶。

浓度为10%的分离胶配制方案如下:

基因引物序列

浓度体积(ml)

10%10

蒸馏水2.7

30%Acr-Bis3.3

1MTris(PH8.8)3.8

10%SDS0.1

10%AP0.1

TEMED0.004

浓度为12%的分离胶配制方案如下:

浓度体积(ml)

10%10

蒸馏水2.0

30%Acr-Bis(29:1)4.0

1MTris(PH8.8)3.8

10%SDS0.1

10%AP0.1

TEMED0.004

②制作分离胶:用移液器枪头紧贴胶槽边缘快速注入5ml分离胶。灌制完毕后注入1ml无水乙醇封口。

③将灌制好的分离胶,室温放置1h,使其凝固。

④5%浓缩胶(6ml),配制方案如下:

组分名称体积(ml)

蒸馏水4.1

30%Acr-Bis(29:1)1.0

1MTris(PH6.8)0.75

10%SDS0.06

10%AP0.06

TEMED0.006

⑤灌制浓缩胶:待分离胶凝固后,倒掉无水乙醇,用滤纸沿分离胶边缘吸尽残余无水乙醇。用移液器紧贴胶槽边缘迅速注入3ml浓缩胶,水平插入梳子,防止气泡产生。

⑥浓缩胶凝固后,将胶槽放入电泳槽中,注入电泳液,轻轻拔掉梳子。

⑦上样:每孔上样蛋白50μg。第一孔蛋白Marker上样量为3μl。

⑧电泳:先用80V电压跑至浓缩胶与分离胶分界线时,将电压调高至100V,直至跑到Marker的各条带彻底分离时,终止电泳。

⑨切胶:取出玻板,在Marker对应的目的蛋白的位置切下所需胶条,然后将胶条浸泡在电转液中。

⑩滤纸准备:对照胶条拆剪滤纸,泡在电转液中待用。滤纸需略小于胶条。

○11电转膜准备:对照胶条剪膜,剪好后将膜浸泡于甲醇15s活化后,移至电转液中。

○12转胶:将夹子打开,在黑色面上放置6层材料,分别为海绵垫3层-滤纸膜-滤纸-海绵垫。用枪头赶走每层间的气泡。

○13转膜:夹子与电转槽黑色面相对放入电转槽中。转膜时间(1kDa转1分钟)。

○14转膜完毕,把膜放入盛有脱脂牛奶的孵育盒中,在摇床上封闭1h,后用PBST漂洗1次。

○15准备一抗:各抗体稀释比例如下

抗体名称稀释比例

人抗小鼠Drp11:1000

人抗小鼠β-actin1:1000

○16将一抗用移液器滴入抗体孵育盒,把膜轻轻盖下(正面朝下),盖上抗体孵育盒盖子,4℃孵育过夜。

○17第二天取出膜,用PBST清洗3次,每次5分钟。

○18配制二抗:按1:2000的稀释比例配制山羊抗人二抗,膜正面朝下,37℃恒温孵箱内孵育1小时。

○19洗膜:将膜置于PBST中漂洗3次,每次5分钟。

○20ECL发光:按说明书要求配制发光液,中性滤纸吸干PBST,放在蜡板上,在膜上滴适量发光液,采集图像。

○21采用Quantity-One软件对条带的吸光度值进行半定量分析,目的蛋白的相对量用目的条带的吸光度值/内参β-actin表示。

1.2.7Drp1过表达慢病毒载体的构建及鉴定

Drp1过表达慢病毒载体的构建及鉴定由上海吉凯基因化学技术有限公司完成。其中lentiviral-Drp1(LV-Drp1)为Drp1过表达慢病毒载体;lentiviral-empty(LV-empty)为空病毒载体。

1.2.8Drp1慢病毒转染N2a细胞

转染预实验:按照由上海吉凯基因化学技术有限公司提供的说明书,用空病毒(LV-empty)确定N2a细胞的最佳转染条件。空病毒以MOI值为5,10,20,40,60转染N2a细胞。添加剂(polybrene)终浓度为(10μg/l),MOI=(病毒密度×病毒悬液量)/(细胞密度×细胞悬液量)。

1)取处于对数期的N2a细胞,以5×103个细胞/孔接种在96孔板中。

2)次日用移液器洗掉培养液,加入新鲜培养液、空病毒和polybrene。

3)12h后更换孔内的培养液为常规培养液,根据细胞状态常规换液。

4)转染后72h用荧光显微镜观察转染情况。

5)转染96h后收集各组细胞提取蛋白。

1.2.9Westernblot检测LV-Drp1对Drp1蛋白的过表达效果

(1)细胞总蛋白的提取:方法步骤同第一部分1.1.2.6;

(2)Westernblot检测N2a细胞转染LV-Drp1后Drp1的蛋白表达。

1)12%SDS-PAGE胶蛋白电泳;蛋白上样量50μg。

2)湿法电转(1kDa/min);转膜。

3)含5%脱脂奶粉的PBST封闭1h;

4)4℃一抗人抗小鼠Drp1孵育过夜,稀释比例1:1000;

5)第二天PBST洗膜后相应的二抗37℃孵育1h;

6)ECL发光并拍照;

7)用Quantity-One软件进行半定量分析。用蛋白相对表达量表示(Drp1蛋白条带的吸光度值/β-actin蛋白条带的吸光度值)。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)