关键词:肺炎链球菌PepO miR-155 TLR2 巨噬细胞 吞噬能力 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

2实验方法

2.1巨噬细胞的提取和培养

给6-8周的C57小鼠腹腔注射无菌石蜡油1ml3-5天后,断颈处死小鼠,酒精浸泡,含EDTA.Na2的无菌PBS10ml灌洗腹腔,轻轻按摩小鼠腹腔,抽取灌洗液,再次用含EDTA.Na2的无菌PBS5ml再次灌洗腹腔后抽取灌洗液。1000rpm离心灌洗液5-10min,吸取液体上面的石蜡油(枪头勿伸入液面下),倾倒剩余液体,DMEM培养基洗涤一遍,1000rpm离心灌洗液5-10min。DMEM培养基重悬细胞,计数铺板。静置2h或过夜后换液,处理细胞。

2.2巨噬细胞的处理

2.2.1吞噬实验的巨噬细胞处理

PepO(1ug/ml)、PepO(HK)(PepO煮沸灭活5min)、PepO(PK)(PepO用蛋白酶K65℃灭活30min)处理巨噬细胞24h。或者PepO(1ug/.ml)处理不同时间点(0、6、12、24h)。

2.2.2提RNA的巨噬细胞处理

PepO(1ug/ml)、PepO(HK)(PepO煮沸灭活5min)、PepO(PK)(PepO用蛋白酶K65℃灭活30min)处理巨噬细胞6h单独观察PepO的效应,或者不同剂量PepO(0-1ug/.ml)处理6h,或者PepO(1ug/.ml)处理不同时间点(0、6、12、24h)提取RNA

1.3实验仪器

观察剂量和时间效应。PepO(1ug/ml)处理WT与TLR2-/-巨噬细胞6h,提取RNA检测miR-155和SHIP1比较WT和TLR2缺陷之间的表达差异。信号通路抑制剂预处理1h后,PepO(1ug/ml)处理WT巨噬细胞6h,提取RNA检测miR-155。

2.2.3转染mimic/inhibitor的巨噬细胞处理

将培养好的细胞转染mimic/inhibitor24h后,PepO处理处理相应时间以备吞噬实验、RNA的提取以及荧光素酶报告检测。

2.2.4荧光素酶活性检测的巨噬细胞处理

Hek293细胞汇合度达到70%后,转染pMIRbasic、pMIRbasic-SHIP1质粒3h后,再转染mimic/inhibitormiR-155,36h后收集细胞。

2.2.5免疫荧光的巨噬细胞处理

不同时间点PepO(1ug/ml)、LPS(100ng/ml)、PGN(5ug/ml)处理WT与TLR2-/巨噬细胞,检测CR3及NF-κB的表达。

2.2.6Westernblot的巨噬细胞处理

不同时间点PepO(1ug/ml)处理WT与TLR2-/-巨噬细胞,检测SHIP1、Akt、NF-κB及β-actin的表达。

2.3细菌悬液的制备

实验前一日取出保存的金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌D39菌种,分区划线接种于哥伦比亚血琼脂平板,37℃,5%CO2条件培养过夜。无菌PBS冲洗血平板的单个菌落,调节OD600=0.5。吸取1000ul菌液12000rpm离心1min,弃上清,无菌PBS洗涤细菌沉淀两次,重悬至浓度约1×107CFU/ml。

2.4经典吞噬实验

巨噬细胞按实验要求处理后,将金黄色葡萄球菌按MOI=1:100感染巨噬细胞30min,无菌PBS洗涤细胞外多余的细菌2次,0.2%TritonX-100裂解细胞3min,将裂解液10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍稀释后,取10ul裂解液滴至普通哥伦比亚血平板,37℃,5%CO2条件培养过夜,第二日观察并计数血平板上SA菌落数。

2.5免疫荧光法的吞噬实验

巨噬细胞按实验要求处理后,将肺炎链球菌用FITC避光标记30min,无菌PBS洗涤3遍,然后65℃灭活30min。无菌PBS重悬细菌,按MOI=1:100感染巨噬细胞30min,无菌PBS洗涤游离的肺炎链球菌3遍。4%多聚甲醛固定5min,无菌PBS洗涤3遍。DAPI染核10min后PBS稀释3遍,封片荧光观察。全过程避光。采用吞噬百分率统计。

2.6巨噬细胞mRNA

2.6.1总mRNA提取及逆转录

细胞按上述处理后,吸取上清,加入1mlRNAisoplus静置5min,吹打30次转移到RNase-free-EP,加入1/5体积氯仿,用手剧烈震荡15秒,充分乳化,无分相现象(不能用振荡器混匀,易造成DNA,RNA物理降解)室温静置5min,4℃,13000g,15min;取水相,转入新的EP,加入等体积(450ul)的异丙醇,上下颠倒离心管,充分混匀(轻),室温静置10min,4℃,13000g,10min。小心弃上清,加入1ml75%的无水乙醇(现配)4℃,13000g,10min,弃上清,用加样枪吸取。瞬离,吸去残余水分,开盖,室温自然晾干。加20ul0.1%DEPC水溶解总RNA。取1.5ul用于紫外分光光度计测定总RNA浓度;5ul用于1%琼脂糖凝胶电泳,观察有无总RNA降解及DNA污染,剩余标本置于-80℃冰箱冻存。整个过程应注意无酶操作,避免RNA降解,DEPC为有毒物质应做好防护工作。逆转录PCR体系及条件

5×PrimeScriptBuffer4ul

PrimeScriptRTEnzymeMixI1ul

RTPrimerMix1ul

OligodTPrimer1ul

Random6mer1ul

RNasefreedH20补齐至20ul

PCR反应(1个循环):37℃15min,85℃5s。

2.6.2miR-155和SHIP1mRNA表达荧光定量PCR

SYBRPremixEXTaq5ul

PF(10uM)0.4ul

PR(10uM)0.4ul

cDNA1.0ul

RNasefreedH203.2ul

预变性:95℃30s。PCR反应(40个循环):95℃5s,60℃30s,72℃10s。

本部分实验所使用引物由上海生工生物及吉玛公司合成。

2.8Westernblot

将处理好的细胞加120ul蛋白酶抑制剂和磷酸化酶的细胞裂解液(RIPA),加入1/3体积的4×LoadingBuffer。总蛋白20ug每孔,经SDS-PAGE电泳80V,40min,120V,80min;210mA恒流转膜70min;5%脱脂奶粉37℃封闭2h;一抗1:1000稀释,4℃孵育过夜;0.1%TBST洗膜液洗涤15min,洗3次;二抗1:5000稀释,37℃孵育1h;0.1%TBST洗膜液洗涤15min,洗3次;显色液A:B=1:1混匀后,凝胶成像仪分析。

2.9免疫荧光染色

2.9.1CR3的检测

(1)巨噬细胞处理4%多聚甲醛固定细胞5-10min,PBS洗涤3次;(2)通透封闭:含0.2%TritonX-100的PBS中室温通透5-10min,随后PBS浸洗3次;5%驴血清封闭1h,37℃;(3)抗体孵育:PEanti-mouseCD11b(1:100),37℃,1h,PBS洗涤3次;(4)复染及封片:DAPI(1:1000)室温孵育15min,PBS浸洗5min3次,防淬灭剂封片镜检。2.9.2NF-κB的检测

(1)巨噬细胞处理好4%多聚甲醛固定细胞5-10min,PBS洗涤3次;(2)通透封闭:随后将切片置于含0.2%TritonX-100的PBS中室温通透10min,随后PBS洗涤3次;5%驴血清封闭1h,37℃;(4)抗体孵育:一抗为兔抗小鼠p-NF-κB多克隆抗体(1:200),4℃过夜,PBS浸洗5min3次;二抗为AlexaFluor594标记驴抗兔IgG(1:800),37℃避光孵育1h,PBS浸洗5min3次;(5)复染及封片:DAPI(1:1000)室温孵育10min,PBS浸洗5min3次,防淬灭剂封片镜检。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)