关键词:原花青素 慢性非细菌性前列腺炎 MIP1-α MMP-9 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.6实验动物取样及处理

(1)用乙醚处死大鼠,立即摘取前列腺,肉眼观察大鼠前列腺组织形态、大小、与周围组织黏连情况等并做记录。

(2)取组织:将大鼠的前列腺分成两块,取一块浸泡于4%福尔马林溶液中待用(病理切片)。另一块组织分成两片,将其中一片组织立即放入液氮中保存(RealtimePCR待用);另一片组织匀浆处理保存(SOD、MDA检测待用)。

(3)组织匀浆提取前列腺组织蛋白:取一块前列腺组织,捣碎后,按前列腺组织100mg:1ml0.9%氯化钠溶液配置于小烧瓶,用匀浆器充分搅拌制成匀浆(为防止过热变性,搅拌时应间断暂停),整个操作须在冰水浴中进行,搅拌好后吸取匀浆加人离心试管中,3000r/min离心10min,取上清液,保存于-20℃冰箱(SOD、MDA检测待用)。

(4)组织匀浆蛋白含量测定:采用Bradford蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度,严格按照说明书操作。

1.7前列腺组织病理切片HE染色

1.7.1组织蜡块制作

前列腺用10%福尔马林溶液固定1周后取出,修整后,分别用70%、85%、95%、100%的乙醇梯度脱水,再用二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)浸泡,浸泡时间分别为0.5-1h、0.5h至组织透明,然后浸泡于石蜡液中((Ⅰ)、(Ⅱ)分别浸泡2h),再将浸过蜡的前列腺组织用石蜡包埋。

1.7.2组织石蜡切片

取40%甲醛2.5ml,明胶0.5g,用蒸馏水定容至100ml。配制成甲醛明胶溶液。将洁净的载玻片置于甲醛明胶液液体中浸泡数分钟,烤干备用。适当修整蜡块后,在切片机上切成2μm厚的切片,捞于载玻片上,展片后放入40℃水浴锅水浴加热,而后将适当展开的组织切片从水浴锅中挂到载玻片上,于45-55℃在烤箱中烤片。

1.7.3HE染色

将烤好的切片经二甲苯脱蜡后再依次浸入100%~70%乙醇中,而后进行HE染色。取出烤好的切片做以下处理:二甲苯Ⅰ10min、二甲苯Ⅱ10min、无水乙醇5min、95%乙醇5min、80%乙醇5min、70%乙醇5min、蒸馏水5min、苏木素染色5min(可调整时间)、流水冲洗10min、蒸馏水洗涤一遍(数秒)、95%乙醇5s、伊红染色液2min、蒸馏水2min、70%乙醇2min、80%乙醇2min、95%乙醇2min、无水乙醇2min、二甲苯Ⅰ2min、二甲苯Ⅱ2min,最后用中性树脂封片高倍镜下(×200)观察前列腺腺腔内分泌物、腺上皮情况和间质内炎细胞浸润、纤维组织增生以及腺体和腺腔的形态学变化情况。

1.8检测MMP-9、MIP-1α基因的表达

取大鼠前列腺组织放入RNAlater中,按照试剂盒说明操作,用Trizol试剂盒提取总RNA,实时定量PCR测定组织中MMP-9、MIP-1αmRNA的表达。

1.8.1RNA提取

(1) 取适量前列腺组织于碾钵中,碾磨过程中适时添加液氮,最后将粉末转移到1.5ml离心管中,动物组织与Trizol比为50mg:0.5ml。

(2)加入100μl的氯仿/异戊醇(24:1),剧烈震荡30s。

(3)台式离心机上,12000rpm,4℃离心5min。

(4)将上清液转移到灭菌1.5mlRnase-free离心管中,加入无水乙醇150μl,混匀。

(5)将上述混匀的溶液全部转移到放于2ml收集管内的UNIQ-10柱中,室温放置2min,之后8000rpm低温离心1min。

(6)小心取出柱子,弃去收集管中的废液,将柱子放回收集管中,加入450μlRPESolution,10000rpm低温离心30s。

(7)重复步骤6一次。

(8)小心取出柱子,弃去收集管中的废液,将柱子放回收集管中,10000rpm低温空转15s。

(9)小心取出柱子,放入无菌的RNase-free的离心管中,在膜的中心小心加入50μl的DEPC-H2O,55-80℃放置2min。

(10)10000rpm离心1min,收集管中的溶液即为RNA样品,可立即使用或-70℃保存。

1.8.2逆转录反应

将提取出的总RNA样品在65℃条件下温浴5分钟后,立即放于冰上冷却。而将每个样品取出7μl进行反转录实验,逆转录反应条件为:37℃15min后98℃下5min。逆转录后样品置于-80℃保存。

反应体系为:

5×RTBuffer(μl)2

RTEnzymeMix(μl)0.5

PrimerMix(μl)0.5

RNA(μl)7

1.8.3RealtimePCR实验

引物序列分别为:

引物名称 上游引物 下游引物 片段大小(bp)

MMP‐9 5’‐GTGACACCGCTCACCTTCAC‐3’ 5’‐GCGTGTGCCAGTAGACCATC‐3’ 122 

MIP1‐α 5’‐CTGGGTCCAAGAATACATC ‐3’ 5’‐ GAAGAGTCCCTGGATGTG ‐3’ 217 

Beta actin 5'‐CGTGCGTGACATTAAAGAG‐3' 5'‐TTGCCGATAGTGATGACCT‐3' 132 

1.8.4MMP-9部分

(1)反应液配制:

蒸馏水(μl)6.4

SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix(μl)10

ForwardPrimer(μl)0.8

ReversePrimer(μl)0.8

样品溶液(μl)2

(2)PCR循环条件

95℃下高温预变性2min后,95℃高温变性15s,56℃低温退火15s,72℃延伸20s,经40个循环。最后绘制出溶解曲线图。

1.8.5MIP1-α部分

(1)反应液配制:

蒸馏水(μl)6.4

SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix(μl)10

ForwardPrimer(μl)0.8

ReversePrimer(μl)0.8

样品溶液(μl)2

(2)PCR循环条件:

95℃下高温预变性2min后,95℃高温变性15s,52℃低温退火15s,72℃延伸20s,经40个循环。最后绘制出溶解曲线图。

1.8.6基因表达量的计算

按以下方法分别计算MMP-9和MIP1-α基因表达量:△Ct=检测指标Ct值-对应内参Ct值,设正常组的基因表达量为1,则2-△Ct为实验组的基因较正常组基因表达量的倍数。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)