关键词:体内MMP13抑制剂 BACE1 APP PS1 鼠行为学 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.2WesternBlotting

(1)组织蛋白提取:1)从每个组织(皮层/海马)样本中取约0.5g,放入1.5ml离心管中,并置于冰上待用;2)在冰上向每个组织样品中加入400ul预先配好并解冻的组织裂解液;3)用组织匀浆器匀浆组织,使其充分裂解。4℃低温离心12000rpm15min,离心后吸取上清液于新的离心管中,冰上放置;4)蛋白浓度测定:将BSA配制成浓度1mg/ml的蛋白标准溶液,-20℃保存;根据标本的总数量,将BCA试剂A:试剂B按50:1的比例配制适量BCA工作液,室温保存备用;分别将0、1、2、4、8、12、16、20μl的蛋白标准溶液(1mg/ml)依次加入至96孔板中,加PBS将每孔补足到20μl;分别将2μl的待测蛋白样品依次加入96孔板的样品孔中,每个样本3次重复,加PBS将每孔补足20μl;每孔分别加入200μl的BCA工作液,37℃放置30min;酶标仪测定波长为A562时各孔的比色值,根据比色值与BSA蛋白标准品的浓度绘制标准曲线,并根据其公式计算出各蛋白样品的浓度,然后计算出WB样品的上样量。5)根据各样品的容积,按1:1加入2X上样缓冲液buffer。煮沸10min。-80℃保存待用。(2)WesternBlotting具体实验步骤同前。

1.2.3免疫荧光实验方法

(1)将冰冻切片室温晾干后,用4%多聚甲醛固定5min,PBS洗3次,每次洗5min;(2)将标本置于事先加热至沸腾的枸橼酸钠溶液中用微波炉继续加热15min进行抗原修复;(3)冷却后再PBS洗3次,每次5min,然后在37℃水浴箱中用山羊血清封闭60min;(4)用PBS配制兔抗MMP13抗体(1:50)+鸡抗MAP2抗体(1:50)+小鼠抗GFAP抗体(1:50)一抗混合液;将配好的一抗混合液加至对应的切片标本上,放于4℃冰箱内孵育过夜;(5)次日将切片于37℃恒温孵育60min,用PBS冲洗3次,每次10min;避光条件下用PBS配制二抗混合液:DyLight488山羊抗兔IgG(1:100)+DyLight549山羊抗小鼠IgG(1:100)+DyLight405山羊抗鸡IgG(1:100)。将配好的二抗混合液加至相应的切片标本上,37℃水浴箱中孵育60min;(6)避光条件下PBS洗片3次,每次5min;然后用甘油和PBS按1:1配成封片液进行封片(7)用激光共聚焦显微镜采集图像。

1.2.4免疫组化实验方法

1)用4%多聚甲醛固定脑组织,石蜡包埋切片,贴片。2)PBS洗3次,每次5min,0.3%H2O2-甲醇室温孵育30min3)PBS洗3次,每次5min,加入0.5%TritonX100处理30min以增加膜的通透性。4)PBS洗3次,每次5min,山羊血清37℃孵育20min。5)弃掉血清,加入鼠源性Aβ抗体(1:200),4℃孵育过夜。6)PBS洗3次,每次5min,加入HRP偶联二抗1:500,37℃孵育1h7)PBS洗3次,每次5min,加入DAB显色液,普通光学显微镜下观察显色。8)梯度酒精脱水后,中性树胶封片。光学显微镜下,采集图片并分析。

1.2.5动物行为学方法1.2.5.1Morris水迷宫方法

为了排除外界环境因素干扰,在行为学实验开始前1周,将小鼠从实验动物中心取出置于行为学实验室,使其适应新环境。实验第一天,先进行运动能力测试,排除游泳能力缺陷的小鼠。Morris水迷宫22℃-25℃的恒温游泳池有东南西北4个象限,平台所在象限为第4象限,直径为8cm。整个游泳池颜色呈黑色,直径1.2米。Morris水迷宫测试包括前5天的平台试验和第6天的探测试验。在平台试验时,将软件设置成探索最长时间为60s,平台停留时间为5s。同时为了排除颜色干扰,用白色食用色素将水染成白色,以便摄像追踪系统对黑色小鼠的识别。小鼠面向水边缘入水,待其找到平台。若未能在60s内找到平台,试验者引导其找到平台并使其在上停留10s。每个象限依次进行,小鼠进行下一象限试验间期时间维持在30min以上。连续训练5天完成平台试验。此后撤掉平台,进行探索试验。所有小鼠从第2象限入水[41]。视频追踪系统记录,软件分析,统计平台试验中的上台潜伏期,及探索试验中的第四象限探索时间及路程和平台穿越次数。

1.2.5.2场景恐惧实验方法

场景恐惧实验按3天的常规测试方法[42]。在实验第一天,小鼠先在训练室适应环境120秒,然后再接受一个30秒声音刺激(2800赫兹,85分贝,30秒),最后2秒同时接受足电刺激(0.45mA,2秒),此后又有120s的适应期。此过程重复3次。在实验第二天,小鼠仅置于训练室中,但无任何刺激。最后一天,小鼠在120s的适应期后仅接受一个30秒声音刺激不伴有电刺激。每只小鼠实验结束后用70%的乙醇清洗训练室以减少小鼠的气味干扰。视频追踪系统记录和分析各只小鼠的凝滞时间和凝滞次数。

 

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)