关键词:体外MMP13抑制剂 BACE1 蛋白表达 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

1.2.2实验步骤

1.2.2.1传代细胞的培养及传代

(1)传代细胞的复苏:从液氮容器中取出冻存管,浸入37℃水浴箱并不时摇动使其尽快融化。取出冻存管,在无菌的超净台里小心的打开盖子,用吸管轻轻的上下吹打几下吸出细胞悬液,加入到离心管中并加入10倍以上培养液,混匀。离心1000rm,5min。弃去上清液,为了使细胞打散和降低细胞损伤,先在离心管外面底部处轻轻拍打10下,然后加入含10%小牛血清培养液轻吹几下,重悬细胞,计数,调整细胞密度,接种在培养瓶里,放37℃培养箱静置培养。次日更换一次培养液,继续培养。(2)传代细胞的冻存:配制含10%DMSO小牛血清的冻存培养液。取对数生长期的细胞,移去上清液用胰蛋白酶消化细胞,1-3分钟,然后加入培养液终止消化反应。用移液枪轻轻吹打瓶壁和悬液使细胞均匀,然后将细胞悬液移至离心管中,离心1000rm,5min。弃去上清液,在离心管外面底部细胞处轻轻拍打几下,然后加入适量配制好的冻存培养液,用吸管轻轻吹打让细胞均匀地装入冻存管中,细胞的最终密度为1×10^6/ml-5×10^6/ml。在冻存管上标记细胞的名称,冻存时间及操作者,放入冻存盒中过夜,然后移入液氮容器中。

1.2.2.2传代细胞的药物及其他处理

(1)各个药物的储存浓度:DMSO:WAY17052310mM,CL8219850mM,34161020mM,LY29400250mM,Wortermin1mM,ActinomycinD(ActD)2mM,cyclohexane(CHX)2mg/ml,MG13210mM,4EGI1125mM超纯水:Chloroquine(CQ)100mM,3-MA200mM(2)各个药物的工作浓度:WAY1705230.01uM,CL821985uM,3416104uM,LY29400210uM,Wortermin0.1uM,3-MA50Um,ActD0.5uM,CHX5uM,MG13210uM,4EGI125uM,CQ100uM。所有处理中DMSO的浓度均低于1:2000。

1.2.2.3细胞处理及分组

(1)将1x105个HEK293细胞或5x105个SH-SY5Y细胞或1x105个HT22细胞接种到六孔板中,培养24h后再加入相应的处理。(2)实验分组:对照组的DMSO和实验组DMSO的浓度比例保持一致。具体操作步骤见结果。

1.2.2.4样本处理与WesternBloting

(1)细胞在药物处理后,用冰的PBS洗两遍,于冰上加入适当体积的细胞裂解液,用细胞刮将细胞刮下来,然后用移液枪将其加入事先标记好的1.5ml的离心管中,煮沸5min。然后用细胞超声粉碎机将细胞打碎,4℃低温离心10min。-80℃低温保存待用。

(2)WesternBlotting方法

1)配胶:将玻璃板洗净晾干,配制8%分离胶和5%浓缩胶,室温静置约30min,使其凝固待用。2)上样,电泳:固定好胶板后,在电泳槽中加入事先配好的电泳液1000ml,拔出梳子,将3ul蛋白预染Marker和10ul蛋白样品量分别加入相应泳道。先用80V约20min使其到达下层胶,然后120V约60min,使溴酚蓝到达分离胶底部。3)转膜:将据分子量大小裁剪的PVDF膜浸泡在甲醇中约15s使其激活。从电泳槽中取出胶板,倒出电泳液,加入1000ml转膜液,根据Marker大小将目的蛋白切开,按照(-)黑板-海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白板(+)的顺序夹好,将夹子放入转膜槽中,按400mA恒流转膜30min。4)封闭:转膜结束后,将膜置于丽春红溶液中浸泡3-5min,观察转膜情况。根据Marker裁剪出目的蛋白大小的条带并编号,用TBST洗3次,然后室温用5%脱脂奶粉封闭1h;5)孵一抗:封闭结束后的膜用TBST洗3次后,将其放入事先配好的相应的一抗稀释液中,4°C缓慢摇动孵育过夜6)孵一抗:次日将膜用TBST液清洗3次后,放入用封闭液按1:5000稀释二抗中,室温缓慢摇动孵育1h。7)显影:将膜用TBST洗3次,ECL化学发光液A和B按1:1比例混匀,均匀滴加到膜上,Fusion成像系统扫描分析。8)统计:用quantityone软件分析各个条带的分度值,并整理记录便于统计。

1.2.2.5样本处理与实时定量PCR

(1)细胞RNA的提取1)将药物处理后的细胞用PBS洗一次后,每孔中加入1mLRNAisoPlus,裂解约5分钟后,用移液枪吹打细胞使其脱落,并将裂解液吸入到灭酶的1.5mlEP管中,室温静置5min。2)再分别加入200μL氯仿,用手剧烈颠倒使其充分混匀,静置3min,再4℃离心12000g15min。3)离心后的液体呈三层分离,将上清液转移到新的灭酶的1.5mlEP管中,此时尽量避免吸到中间的蛋白层沉淀,然后加入等体积的异丙醇,上下颠倒混匀,静置10min,4℃离心12000g10min。4)离心后可见管底有少许白色沉淀,弃去上清,加入1mL用DEPC水配制的75%乙醇,上下颠倒洗涤,4℃离心7500g5min,小心弃上清。5)将EP管倒置于滤纸上,干燥5-10min,加入20-50ulRNase-free水溶解RNA,56℃10min。然后用微量核酸蛋白检测仪测定其浓度和纯度,-80℃保存。(2)RNA的质量鉴定及逆转录1)将提取的RNA5ul做琼脂糖凝胶电泳,恒压140V,30min,紫外线下观察条带的分离情况。观察到28S、18S两条尖锐的条带,28S条带的亮度为18S条带亮度的2倍,则表示RNA完整。其次进行纯度检测,OD260/OD280在1.7^2.1之间。即可认为RNA质量合格。2)RNA的逆转录根据PrimeScriptRTregentKit说明书操作。反应总体系为20μL,包括5×PrimeScriptBuffer4μL,PrimeScriptRTEnzymeMixⅠ1μL,OligodTPrimer1μL,Random6mers1μL,总RNA1000ng,RnaseddH2O补齐。反转录程序为:37℃15min,85℃5s。反转录产物-20℃保存。(3)实时定量PCR实时定量PCR根据SYBR®PremixExTaq™II说明书操作。反应总体系为20μL,其中包括SYBRPremixExTaq(2×)10μL,上下游引物(10μM)各0.4μL,cDNA模板2μL及ddH2O7.2μL。荧光定量PCR仪用两步法扩增目的基因,其程序为:预变性,95℃30s;扩增40个循环:95℃5s,60℃34s。以GAPDH作为内参,所用引物序列见Table1。引物特异性用扩增曲线来检测,扩增曲线的程序如下:95℃15s,60℃60s,95℃15s。单峰则说明扩增产物单一。软件所得到的CT值按相对比较法进行计算和统计。

1.2.2.6MTT细胞活力检测

1)将1×104个的相应细胞接种到96孔板中,在37℃,5%CO2细胞孵箱中培养24小时,使其良好贴壁。2)加入相应的药物进行处理,每组三个复孔,CL821985uM,LY5uM,10uM孵育24小时后加入10ulCCK-8试剂,混匀,孵育2h后,酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度。将处理组/对照组的比值用于统计分析。1.2.2.7质粒构建与细胞转染(1)人的pcDNA4-His-Myc-BACE1质粒,人的BACE1的启动子萤火虫荧光素报告基因质粒p4BU-1591/-402,p4BU-1591/+1为重庆医科大学附属儿童医院周卫辉教授所赠。人的pBACE1-691/+67为美国Roswellpark癌症研究所罗伟教授所赠。人的pCMV-MMP13(SC123911)过表达质粒和人的pCMV-eIF4B(SC119269)过表达质粒均购买于美国ORIGENE公司。小鼠来源的MMP13shRNA购买于中国上海吉凯基因化学技术有限公司,其序列来源于文献报道[6]。(2)人的BACE1-5’UTR质粒构建[30]1)BACE1的5’UTR引物设计如下:

BACE1-5’UTR-F:5’CCGCTCGAGTCCCCAGCCCGCCCGGGAGCT3’XhoI

BACE1-5’UTR-R:5’CCGGAATTCGGTGGGCCCCGGCCTTCGGG3’EcoRI

2)提取人脑组织的基因组DNA,以其为模板PCR扩增BACE1的5’UTR基因片段。PCR产物与克隆载体pMD19Tsimple连接构建pMD19T-BACE1-5’UTR,测序显示所克隆序列无突变。克隆载体pMD19T-BACE1与携带His和Myc双标签的pcDNA4-BACE1分别以XhoI和EcoRI双酶切,回收402bp的BACE1的5’UTR基因片段与pcDNA4-BACE1载体连接,转化DH5α后菌液PCR。电泳鉴定,得到pcDNA4-His-Myc-BACE1-5’UTR质粒。(3)人的pCMV-eIF4B(S422R)的定点突变质粒的构建pCMV-eIF4B的反向PCR扩增引物设计如下:

eIF4B-F:5’-GGACAGGAAGGGAGTCATCACAAACTGGGACCTCCACCAC-3’

eIF4B-R:5’-GTGATGACTCCCTTCCTGTCCTCGACCGTTCCCGTTCCTGA-3’

用PhantaMaxSuper-FidelityDNAPolymerase对目标质粒进行扩增,电泳鉴定后用Dpnl消化去除甲基化模板质粒,割胶回收目标扩增产物,用ExnaseⅡ催化扩增产物使其同源重组。转化DH5α后测序显示所克隆序列在422位点上突变成功。即得到pCMV-eIF4B(S422R)质粒(MutExpressMultiSFastMutagenesisKit,China,Vazyme)。

(4)细胞转染1.贴壁细胞:将2×105个的相应细胞接种到6孔板中,并用不含抗生素的培养基在37℃,5%CO2细胞孵箱中培养24小时,使其良好贴壁,并确保转染时细胞的汇合度在60-80%左右。2.转染混合物的制备步骤如下:A.用100μl/孔不含血清的培养基稀释2.5ug/孔DNA并混合均匀。B.将转染试剂混合均匀后,将5ul/孔用100μl/孔不含血清的培养基进行稀释。室温下孵育5min。C.孵育5min后,将稀释后的DNA与稀释后的转染试剂混合(总体积200μl/孔)。在涡旋震荡仪上涡旋10s左右,室温下孵育20min。3.将200μl/孔的转染复合物加入到含有细胞和700ul/孔培养基的培养皿中,混合均匀。37°C的CO2细胞孵箱中培养,4-6h后可以更换新鲜的细胞培养基,18-48h后进行基因表达情况的检测。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)