关键词:低氧 SPOP PTEN PI3K AKT信号通路 EMT 绒癌 生长转移 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

2实验方法

2.1细胞培养

HTR8-SVneo、JAR和JEG3细胞均属于人类滋养层细胞系,HTR8-SVneo和JAR由本实验室保存,JEG3细胞购自上海中科院细胞库。其中HTR8-SVneo细胞是永生化的人绒毛膜外滋养细胞,JAR和JEG3均是绒毛膜癌细胞株。采用RPMI1640培养液于37°C、5%CO2环境下培养HTR-8/SVneo和JAR细胞,DMEM/F12培养液培养JEG3细胞(血清浓度为10%,双抗浓度为:青霉素100U/mL,链霉素100ng/mL)。培养基每两天更新一次。做缺氧实验时,JAR和JEG-3细胞单层培养细胞密度达到70%左右时加化学试剂氯化钴(Cocl2)处理,其最终工作浓度为150μmol/L。

细胞的冻存与复苏:冻存细胞前,应先检测细胞的状态是否良好,是否有细胞的污染,并预先配制含有90%胎牛血清和10%DMSO的细胞冻存液。胰酶消化离心后,弃掉上清,留细胞沉淀。向细胞沉淀中加入细胞冻存液,做好标记,将冻存管放到冻存盒中。在4℃放置半小时,之后在-20℃放置1小时,再将冻存盒转移至-80℃冰箱过夜,次日再转移至液氮中长期保存。在复苏细胞时,用镊子从液氮罐中取出细胞,放于37℃水浴锅中快速融化。待冻存液全部融化成液态后从水浴锅中取出,用消毒酒精喷淋冻存管外壁,擦干之后转移到超净台。用移液枪把含有细胞的冻存液吸出,加入到含有培养基的离心管中(提前在离心管中加入完全培养基3ml左右),800rpm离心5分钟,弃上清,细胞沉淀用新鲜培养基重悬,

加入到培养瓶中,37℃5%CO2培养箱培养。

2.2慢病毒转染

(1)第一天,准备细胞:待细胞进入对数生长期时,用0.25%的胰酶消化细胞以制备单细胞悬液。再将JAR细胞重新接种到12孔板中,每个孔内接种细胞8-10X104个细胞,每孔加入培养基体积为1ml,进行培养24h至贴壁。

(2)第二天,感染目的细胞:待贴壁细胞融合达到50%~60%时进行慢病毒转染。首先提前从-80°C冰箱取出病毒,放于冰上使其慢慢融化。吸去原有12孔板中的培养基,用PBS洗三次后,再加入新鲜的培养基600ul,再向每个孔中加入适量病毒悬液(根据MOI值准确计算每孔加入的慢病毒体积),混匀后放于37°C、5%CO2培养箱继续孵育24h。

(3)第三天,吸去含有病毒的培养基,用PBS洗三次,再换上新鲜的正常培养基继续培养24-48小时,并观察细胞的状态。

(4)在慢病毒感染48-72小时后,可在倒置荧光显微镜下观察荧光,估计慢病毒感染目的细胞的效率,并继续传代扩大培养。待转染病毒的4-6天后开始加嘌呤霉素筛选,以获取最高的转染效率。

2.3细胞总蛋白的提取

(1)待培养瓶中的细胞融合密度达到80%~90%时进行总蛋白的提取。首先将细胞经预冷的PBS洗3次后,彻底倒掉PBS。将培养瓶斜放在冰盒上,使其未能倒干净的部分能流到一角,然后再用移液器将残留的PBS吸干净。

(2)加入适量的蛋白裂解液,按照RIPA蛋白裂解液:蛋白酶抑制剂PMSF=100:1的比例新鲜配制。用移液枪将蛋白裂解液均匀的铺平到培养瓶中,于冰上反复吹打5min,再将放有培养瓶的冰盒置于摇床上摇30min,使其充分裂解。

(3)用干净的细胞刮将培养瓶中的细胞刮下,然后将裂解后的细胞碎片产物收集于1.5ml预冷的EP管中。

(4)于4℃离心机12000rpm离心15min(提前开启离心机预冷)。

(5)将离心后的上清液全部转移至新的1.5ml的离心管中,做好标记。每管各取3ul蛋白上清液,进行BCA蛋白定量实验。

1)首先将BCA试剂盒取出室温下融化,按照A:B=50:1的比例制备所需的蛋白反应体系,并将A液和B液充分混匀。

2)取出1个96孔板,每孔加入200ul的A、B混合液,按下表的要求分别加入双蒸水,蛋白标准品及待测样品到混合液中,充分混匀,置于37℃条件下孵育30min。

BCA法测蛋白浓度所加溶液的比例

样本双蒸水(ul)蛋白标准液(ul)待测样品(ul)

1015-

2213-

3411-

469-

587-

6105-

7150-

待测组12-3

3)孵育结束后,从37℃孵箱取出96孔板,562nm波长下测定其吸光度值(OD值)。

4)根据蛋白标准品的浓度和吸光度值制备标准曲线,根据标准曲线和待测样品的吸光度值,计算出待测样品的蛋白浓度。

5)向离心后的蛋白上清液中加入蛋白上样缓冲液(5X),按照蛋白样品:上样缓冲液=4:1体积比例混匀,在沸水中煮沸10min,提取的蛋白长期于-80℃保存。

2.4Westernblotting法检测蛋白的表达

(1)提前将要用的玻板洗干净,然后蒸馏水润洗两次,在烤箱烤干。短玻板和长玻板对齐夹紧固定在橡胶条上,注意不能留缝隙,以免漏胶。

(2)配胶:根据蛋白分子量的不同,分别配制8%和10%的分离胶。不同浓度的SDS聚丙烯酰胺胶的配方见下表,配胶过程全在冰上操作,以减缓胶的凝固。分离胶按照表中的溶液混匀后,缓慢的加入到两玻板之间。加入的量略高于夹子的最高处(或者胶面达到短玻板的2/3处),再加入2ml的无水乙醇将胶压平。

(3)室温放置30-40min,当无水乙醇与胶之间有一条明显的分界线时,说明分离胶已凝固。倒去上层的无水乙醇,再用吸水纸尽量的把残留的乙醇吸干净。

(4)配5%的浓缩胶:浓缩胶的配方如下所示,缓缓倒入到玻璃板间,并插上梳子,室温放置30min。

8%SDS聚丙烯酰胺凝胶配方

浓度(8%)试剂10ml15ml

蒸馏水3.3ml5ml

30%聚丙烯酰胺2.7ml4ml

1.0MTris,Ph8.83.8ml5.7ml

10%SDS0.1ml0.15ml

10%过硫酸铵0.1ml0.15ml

TEMED0.006ml0.009ml

10%SDS聚丙烯酰胺凝胶配方

浓度(10%)试剂10ml15ml

蒸馏水2.7ml4ml

30%聚丙烯酰胺3.3ml5ml

1.0MTris,Ph8.83.8ml5.7ml

10%SDS0.1ml0.15ml

10%过硫酸铵0.1ml0.15ml

TEMED0.004ml0.006ml

5%浓缩胶配方

浓度(5%)试剂4ml6ml

蒸馏水2.7ml4.1ml

30%聚丙烯酰胺0.67ml1.0ml

1.0MTris,Ph8.80.5ml0.75ml

10%SDS0.04ml0.06ml

10%过硫酸铵0.04ml0.06ml

TEMED0.004ml0.006ml

(5)待胶凝固后将玻璃板夹上电泳架,完整的长的玻板放在外面,短的玻板放在里面(注意玻板和电泳架之间一定要不能留缝隙,以防电泳液外漏)。两玻板之间倒上电泳液,玻板内侧的电泳液需没过上样孔,观察1分钟,若没有电泳液外漏再缓慢地拔出梳子。

(6)提前从冰箱中取出蛋白,于室温溶解成液态后开始准备上样。每孔加入40ug目的蛋白(根据测出的蛋白浓度,提前计算好每个孔上样的体积),再留一个孔加入5ul左右的Marker进行电泳,并记录上样的顺序。

(7)电泳:电泳条件为:浓缩胶时电泳电压为80v,待蓝色的样本条带进入到分离胶时(或者看到Marker条带分开时,表明已进入了分离胶)将电压调到120v,电泳直至溴酚蓝条带到达玻璃板底端附近处即停止电泳。

(8)切胶:先将玻璃板从电泳架上取下,放在装有转膜液的大培养皿中,轻轻将玻板撬开(注意动作一定要轻,以免损坏凝胶),取出小玻璃板。将浓缩胶切除,分离胶根据目的蛋白分子量的大小切去多余的部分,并用尺子量好长度和度,剪取与凝胶相同大小的PVDF膜。

(9)转膜:我们采用湿转法进行转膜。先将剪取的PVDF膜放于盛有甲醇的培养皿中约2分钟(目的是使甲醇表面的正点基团活化,使其更好的与带负电荷的蛋白质结合),切下的分离胶放于滤纸上,盖上PVDF膜,再盖上滤纸,形成一个类似“三明治”的结构。即负极面(黑色面)上依次放海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵垫,再将转膜夹夹紧。同时注意凝胶和PVDF膜之间不能有气泡,顺序一定不能放反。负极为带负电的蛋白质,正极为PVDF膜。转膜条件为:恒流250mA,转膜时间约2小时。根据蛋白分子量大小不同可适当调整转膜时间。一般蛋白分子量越大,转膜时间也相应越长。

(10)封闭:转膜完毕后,PVDF膜从转膜夹中取出,将膜浸泡在TBST中,用手轻轻摇晃30s,洗去表面的转膜液。再将膜浸泡至含有5%BSA的封闭液中,室温摇床上封闭2小时。

(11)孵一抗:将PVDF膜转到孵育盒内,用5%BSA稀释好的目的一抗覆盖,摇床上4℃过夜。

(12)第二天,吸走一抗回收,若短期内使用,4℃保存,若短期内不用可-20℃保存。加入TBST在摇床上室温洗涤3次,每次10min。

(13)孵二抗:用TBST稀释二抗,需新鲜配制。将稀释好的二抗倒入孵育盒中覆盖PVDF膜,摇床上室温孵育2小时。

(14)2小时后吸走二抗,加入TBST在摇床上室温洗涤3次,每次10min。注意洗第三次后不要立即将洗脱液倒掉。

(15)显影:用辣根过氧化物酶HRP-ECL发光法。首先配制显影液,按照A:B液=1:1的比例混合,配制的量按照每张条带300ul左右计算。将膜从孵育盒中夹出放于滤纸上吸干,正面朝上放置在蜡板上,加入适量的显影液均匀的覆盖PVDF膜,室温下避光孵育5min。孵育结束后放入曝光夹中,在避光的条件下进行曝光和显影。

(16)显影后观察和量化分析采用ImageJv1.48软件分析系统。以GAPDH作为内参照物,目的蛋白/GAPDH灰度比值表示目的蛋白的相对表达量。

2.5TRIzol提取总RNA

实验前,先将低温离心机预冷,准备实验所需的试剂和器材,提前紫外线照射操作台30min。

(1)25cm2培养瓶中的细胞,当密度融合达到80%~90%时可用于提取RNA。先倒掉其培养液,每瓶加入3ml的PBS洗2次,在手上轻轻摇晃,洗完后倒掉PBS,用移液枪吸干残留的PBS后每瓶加入1ml的Trizol试剂,室温静置5分钟。

(2)反复抽吸吹打细胞使其充分裂解,再将含有细胞裂解产物的Trizol试剂移至新的无酶的EP管中,做好标记。

(3)按照每1mlTrizol试剂加200ul氯仿的比例,在每EP管中加入200ul的氯仿,盖上管盖,在涡旋振荡器上震荡15秒,使其充分混匀。然后室温静置10分钟。

(4)4℃离心机12000rpm离心15min。

(5)离心结束后,小心的取出EP管,将离心后的上清液转移至新的无RNA酶的EP管中,大约吸取300ul左右(每次吸100ul,共3次,一次性不要吸太多,以免吸到下层的蛋白和DNA)。

(6)按照吸出的上清液的体积:异丙醇=1:1的比例每管加入300ul左右的异丙醇,上下颠倒离心管,充分混匀。

(7)室温静置10min,静置期间配制75%乙醇,DEPC水:无水乙醇=250ul:750ul。

(8)4°C离心机12000rpm离心10分钟。

(9)离心结束后,弃掉上清,留沉淀,再向沉淀中加入1ml75%乙醇,轻轻颠倒混匀。

(10)于4°C离心机12000rpm离心5分钟,去掉上清,此步骤重复一次。

(11)离心结束后,弃掉上清,留沉淀,开口向内墙倒置,用移液枪将残留水珠吸干净,干燥3-5min,干燥过程中的RNA易降解,注意观察RNA情况,及时加DEPC溶解。

(12)溶RNA于适量DEPC水中(20~50ul),放于冰上,轻轻振荡混匀,用分光光度计测RNA浓度。先用DEPC水反复调零,每个样本测2次,并记录(c:浓度,OD:260/280,OD:260/280),取平均值。

(13)取1ug的RNA,用Takara逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,于-20℃保存,以进行后续的实验,剩余的RNA于-80℃保存。

2.6实时荧光定量PCR

(1)首先根据待测的目的基因序列设计相应的qPCR引物,检测引物质量,选择扩增效率高,特异性好的引物来进行后续的定量实验。

(2)将cDNA,引物和SYBRSYBR®PremixExTaq™II先溶解,参照qRT-PCR试剂盒(Takara)说明书配制定量PCR反应体系,PCR反应体系见表1.5。操作步骤严格按照试剂盒说明书进行,每个反应体系为10ul,每个组合须有3个重复PCR反应。定量PCR的反应体系

试剂10ul反应体系终浓度

SYBRSYBR®PremixExTaq™II5ul1X

正向引物(10uM)0.5ul100nM

反向引物(10uM)0.5ul100nM

模板cDNA0.75ul5ngcDNA

DEPC水补齐至10ul

(3)将配制好的混合物分别加到八联管中,并记录加样的顺序。八联管盖好盖子,用八联管离心机瞬离10s,使其反应体系中的溶液能充分混匀,放到96孔的实时荧光定量PCR仪中。在荧光定量PCR仪上设置好程序,PCR的反应条件为:95℃预变性5min,95℃变性10s,60℃退火延伸30s,共40个循环。采用相对定量方法RQ=2-ΔΔCt计算目的基因mRNA相对于内参GAPDH的表达量。

2.7Transwell侵袭迁移实验

2.7.1侵袭实验

(1)对数生长期的细胞在接种细胞前先血清饥饿12h,继续在37℃培养,去除血清的影响。

(2)提前3小时左右在Transwell小室中铺上稀释后的Matrigel基质胶60ul,放于37℃,5%的培养箱使其凝固。按照Matrigel基质胶:1640=1:8比例稀释

(3)饥饿后的细胞经胰酶消化后离心,去除上清,用不含血清的1640或者PBS悬浮细胞,并在显微镜下计数,调整细胞密度为5X105个/ml左右。

(4)待基质胶凝固后,向小室内加入不含血清的细胞悬液100ul,使对照组和实验组中打入的细胞数量相同,大约为5X104个细胞。24孔板内每孔加入500ul含15%胎牛血清的RPMI1640完全培养基,使Transwell小室底部能全部浸没在培养基中(注意小室和下层培养液之间不能有气泡)。再置于37℃、5%CO2环境下继续培养24-48h。

(5)24-48h后取出小室,用棉签轻轻地擦去基质胶和上室内的细胞,PBS洗3次后用4%多聚甲醛固定15min。

(6)取出小室,结晶紫染色20min。再用PBS洗干净后晾干,将小室放于干净的24孔板中,于倒置显微镜下观察和拍照,随机选择至少6个视野计数侵袭的细胞数。

2.7.2迁移实验

迁移实验的所有步骤和侵袭实验大体相同,只是Transwell小室在加入细胞悬液前不用铺Matrigel基质胶,余步骤与Transwell侵袭实验一致。

2.8划痕实验

(1)所有用的器械包括直尺和marker笔在操作前超净台内紫外照射30min。

(2)先用marker笔在6孔板背后,用直尺比着,横穿孔的中心均匀地划横线,每孔至少穿过5条线。

(3)在六孔板中每孔加入约2-5X105个细胞,具体数量因细胞状态及生长速度不同而不同,掌握为过夜能铺满70%~80%。JAR细胞做划痕实验时,由于细胞成团生长而不能使细胞铺的太满,以免划痕的过程会连带周围的细胞一起划下,使划线不直。

(4)第二天用200ul枪头比着直尺,尽量垂直于背后的横线缓慢划痕,枪头要垂直,不能倾斜。

(5)吸除原培养基,用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入含2%血清培养基。

(6)放入37℃,5%CO2培养箱培养。按0、24和48小时取样,显微镜下拍照。

2.9CCK8实验

(1)取对数生长期的细胞胰酶消化离心,制成细胞悬液,调整细胞的密度为1-5X104个/ml,接种于96孔板中培养,每孔加入100ul培养基,使每个孔的细胞数量大约为3000个,每次接种4个培养板,将细胞培养于37℃、5%CO2环境下24h至细胞贴壁。

(2)分别于不同时间点(0h、24h、48h、72h和96h)加入CCK8试剂进行吸光度值的测定,为保证细胞有充足营养进行生长增殖,在48h时对余下1个培养板更换新鲜培养基。在不同的检测时间点按照每孔100ul(90ul新鲜培养基+10ulCCK8试剂)加入96孔板中,放于培养箱中继续培养2小时。

(3)采用多功能酶标仪检测450nm处的吸光度(OD)值,绘制增殖曲线。实验独立重复至少3次。

2.10siRNA的转染

2.10.1FAM-siRNA的溶解及保存

(1)提前设计siRNA序列,并由吉玛公司合成,基因特异siRNA序列见表2.7。

基因特异siRNA序列

靶基因编号siRNA序列

HIF-1αsiRNA-1CAUGAGGAAAUGAGAGAAAT

siRNA-2CAGAAAUGGCCUUGUGAAAT

(2)由于OligoRNA很轻的干膜状附在管壁上,打开离心管前先离心,再慢慢的打开管盖,溶解时加适量DEPC水后盖上管盖,震荡溶解。

(3)1OD的siRNA溶解为20uM的样品,向EP管中加入附送的125ulDEPC水溶解即可。

(4)溶解的液体避免反复冻融,应分装后于-20℃保存。

2.10.2转染细胞

(1)细胞准备:转染实验前的18-24小时,取对数生长期的细胞经胰酶消化离心后重新接种至12孔板中,调整细胞密度为5-7X104个/孔,每孔加入1ml培养基。确保转染时的细胞密度为30%-50%。

(2)第二天,首先细胞弃去原培养基,用PBS洗3次后换上不含血清的培养基,每孔加入800ul。提前将siRNA放置于室温中使其溶解成液体,转染试剂从冰箱取出提前恢复至室温,用前轻轻摇匀。

(4)在100ul的RPMI-1640(或DMEM/F-12)无血清培养基中加入40pmolsiRNA,柔和混合均匀。

(5)混匀lipofectamin2000试剂,用100ul无血清的RPMI-1640(或DMEM/F-12)培养基稀释4ullipofectamin2000试剂,轻轻混匀,室温静置5分钟。

(6)将稀释好的siRNA和lipofectamin2000试剂混合,轻柔混匀,室温下放置20分钟,以便形成siRNA/lipofectamin2000复合物。

(7)将200ulsiRNA/lipofectamin2000复合物滴加到含有细胞和培养基的12孔板中,来回轻柔摇晃细胞培养板使其充分混合。

(8)细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养6小时,除去复合物,更换上新鲜的培养基。

(9)继续培养细胞24-72小时,收集细胞,进行转染后的其他检测步骤。

2.11免疫荧光

(1)提前准备10cmX10cm的盖玻片,将盖玻片用清洁剂洗干净,然后用自来水将洗洁剂冲干净,再用纯水冲洗3次,泡在75%的酒精中静置10分钟。

(2)用镊子夹起盖玻片在酒精灯上将酒精烧干,温度不可太高。将烧干的盖玻片放于24孔板中,待冷却后将细胞悬液(约5X103个细胞)滴加到盖玻片上,每孔加入500ul的培养基。

(3)待细胞密度达到50%-70%左右并且贴壁良好时进行固定染色。首先将爬片去除培养基,用PBS溶液漂洗2次(漂洗时注意不要吸太干,以防细胞脱落),24孔板每孔加入500ul4%多聚甲醛溶液,室温静置固定15分钟。

(4)固定后吸掉多余的4%多聚甲醛溶液,然后每孔加入500ul的PBS溶液浸洗3次,每次3分钟。

(5)用含有0.5%的Tritonx-100的PBS在室温通透15分钟,PBS室温浸洗3次,每次3分钟。

(6)吸水纸吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA(或者二抗来源的血清),室温下封闭30min。

(7)目的蛋白一抗按照说明书给的比例稀释后,均匀的滴加在盖玻片上,放入湿盒中,4℃孵育过夜。

(8)第二天,PBS浸洗爬片3次,每次3min,吸水纸吸干爬片上多余液体。

(9)滴加稀释好的荧光二抗,湿盒中37℃孵育1h,PBS浸洗爬片3次,每次3min。(注意从加荧光二抗起,后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行)。

(10)滴加DAPI避光孵育5min,对标本进行染核,PBS5min×3次洗去多余的DAPI染料。

(11)用吸水纸吸干爬片上的液体,在载玻片上滴加抗荧光淬灭剂,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量不要产生气泡。

(12)根据二抗的荧光标记,选用相应的激光波段在荧光显微镜下观察采集图像。

2.12免疫组化

2.12.1组织标本的获得

从重庆医科大学病理科获得绒癌组织石蜡切片30张;正常的绒毛组织切片10张,均是从接受人工流产妊娠早期(孕12周前)的健康妇女体内获得。

2.12.2免疫组化

(1)将载玻片置于56℃烤箱2h,在二甲苯Ⅰ中浸泡20min,二甲苯Ⅱ中浸泡20min(脱蜡)。

(2)100%、95%、80%、70%酒精中各浸泡3min,之后在自来水中浸泡5min,再PBS中浸泡5min。

(3)热修复:将玻片置于枸橼酸盐缓冲液中,微波加热至沸腾后,立刻低火维持15min(注意不能煮太久,标本易从玻片上脱落)。

(4)经室温冷却(约1小时)后,PBS洗3min×3次,洗完后,将标本附近擦干(从标本边缘开始滴加,进行清洗,不能直接对着标本)。

(5)3%H2O2室温孵育10min,PBS洗3min×3次,洗完后,将标本附近擦干。

(6)加入目的一抗,4℃孵育过夜(或于37℃烤箱中孵育2h,一般而言过夜孵育效果较好),第二天37℃复温45min。

(7)PBS冲洗5minX3次。除去PBS液,每张切片加1滴聚合物增强剂,室温下孵育20分钟。PBS冲洗3minX3次,洗完后,将标本附近擦干。

(8)每张切片加1滴酶标抗鼠/兔聚合物,室温下孵育30分钟。PBS冲洗5minX3次,洗完后,将标本附近擦干。

(9)每张切片加1滴新鲜配制的DAB液(二氨基联苯胺),显微镜下观察5分钟,出现棕黄色立即放蒸馏水中终止染色。

(10)苏木素复染:染色5-10s左右,立即自来水中清洗,再于蒸馏水中浸泡终止染色,若染色太深,可用1%盐酸酒精冲洗3-5s左右,再用自来水清洗。

(11)70%、80%、95%、100%酒精中各浸泡3min,梯度酒精脱水干燥后在二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡3min。

(12)中性树胶封片,每张片子滴一滴即可,将盖玻片轻放置其上,它可自行覆盖固定。晾干后在显微镜下观察拍照。

2.13裸鼠成瘤实验

(1)转染了病毒的JAR细胞进行大量扩增,取对数生长期的细胞经胰酶消化离心后,去掉上清液,留细胞沉淀。细胞再用预冷的PBS洗2次。

(2)再用PBS或者无血清的培养液重悬细胞,并在显微镜下计数,调整细胞的密度为2X107个/ml,细胞悬液装与EP管中,于冰上保存。

(3)到动物房取出提前准备的约4周龄大小的BALB/c免疫缺陷小鼠,用75%的酒精棉球擦拭小鼠腋下周围皮肤,1ml的注射器吸细胞悬液100ul以皮下注射的方式注入到小鼠的腋下(注意接种前将细胞悬液摇匀,细胞从消化后到注入动物体内,间隔最好不要超过半小时。),注射器尽量打入到皮下至少1cm,以免针头取出时细胞悬液从针孔处溢出。

(4)接种了细胞的裸鼠用耳标做标记,放回笼中,无菌喂养1个月,期间每隔一定时间观察肿瘤的形成情况并详细记录。1个月后处死成瘤裸鼠,取出瘤组织,测量肿瘤的大小和重量,并做好记录。

2.14流式细胞术检测细胞凋亡和周期

2.14.1流式细胞术检测细胞凋亡

(1)取对数生长期的细胞进行所需的处理,特定时间后终止培养,胰酶消化离心后,弃掉上清,收集细胞沉淀(注:胰酶消化时间不易过长,否则容易引起假阳性)。

(2)用预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次(1000rpm离心5min)收集2~5×106细胞。

(3)加入500μL的BindingBuffer悬浮细胞。

(4)加入5μLAnnexinV-PE混匀后,加入等体积的7-AAD

(7-amino-actinomycinD)轻轻混匀,室温避光反应15min。

(5)用流式细胞仪检测,AnnexinV-PE:激发波长Ex=488nm;发射波长Em=578nm。7-AAD:激发波长Ex=546nm;发射波长Em=647nm。AnnexinV-PE发出的荧光通过FL2频道检测;7-AAD在合适波长激发光的激发下可发出明亮的红色荧光。

(6)荧光补偿调节:使用未经凋亡诱导处理的正常细胞,作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠和设定十字门的位置。所有样品的检测必须在1小时内完成。

2.14.2流式细胞术检测细胞周期

(1)取对数生长期的细胞进行所需的处理,特定时间后终止培养,胰酶消化离心后,弃掉上清,收集细胞沉淀。

(2)用预冷的PBS洗涤细胞2次(1000rpm离心5min)收集2~5×106细胞。

(3)逐滴加入预冷75%乙醇,涡旋混匀细胞,于4℃避光固定6h以上。

(4)1000rpm离心细胞10分钟,弃上清。之后用PBS清洗细胞2次以去除所有的乙醇。

(5)细胞染色:后续的具体操作步骤送重庆医科大学生命科学研究院流式细胞室进行检测。细胞周期的测定必须在1小时之内完成。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)