国家财产:ESR1 SDF1 CXCR4轴介导 BMSCs归巢 薄型子宫内膜 密理博 millipore 创博环球 GLOBALEBIO 新星 NEWSTAR 白鲨易 biosharp

 

2实验方法

2.1大鼠BMSC细胞分离培养[18]

3-4周龄健康的SPF级SD大鼠,体重100–120g,使用颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡10min,然后股骨和胫骨单独放在无菌条件下。样品浸入L-DMEM中(含100U/ml青霉素和100lg/ml链霉素,双抗)。在骨干两端的关节囊,不分离骨骺进行切除,然后再分骨干。使用一次性使用无菌注射器抽取L-DMEM(含抗生素)培养基,反复冲洗骨髓腔,并在无菌培养皿中收集细胞。所得细胞悬液在20℃下2500g离心5min后,在含10%胎牛血清的L-DMEM培养基中漂洗一次。细胞在完全培养基中重悬(90%L-DMEM,10%胎牛血清、100L/ml青霉素和100lg/ml链霉素)转移到25cm2塑料培养瓶中,将培养瓶放入培养箱中进行连续培养(设定培养箱参数为37℃5%CO2)。从一只大鼠中分离出的细胞培养在同一个培养瓶中。

2.2慢病毒LV-5载体构建[19]

化学合成包含NsiI/BamHI酶切位点的RatESR1基因编码序列。测序验证序列完全正确后以NsiI和BamHI双酶切。电泳并切胶回收目的片段,以T4连接酶连接至质粒LV5,测序验证序列正确后扩增使用。

2.2.1病毒包装

(1)293T细胞在10cm培养皿中培养至80-90%融合时,接种15cm培养皿。用移液器将培养皿中陈旧的培养液倒掉,使用1mlD-Hank’s缓冲液进行2次细胞洗涤。

(2)在培养皿中加入1ml的Trypsin-EDTA溶液,重复混匀后,在37ºC下静置2-3分钟。

(3)小心吸除培养皿中的Trypsin-EDTA溶液,在其中加入2mlDMEM培养液(含有10%FBS)的,并使用移液器反复吹打,形成单细胞悬浊液。注意吹打过程中不宜太用力。

(4)将细胞悬液接种15cm培养皿,加入10ml含10%FBS的DMEM培养液,混匀后37ºC5%CO2培养过夜。

(5)在一支无菌的5ml离心管中加入1.5ml无血清DMEM,按比例加入含目的序列的穿梭质粒和包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G),混匀,取另一支无菌的5ml离心管,加入1.5ml无血清DMEM,再加入300ulRNAi-Mate,混匀,室温放置5分钟后将两管混合,室温放置20~25分钟。

(6)将培养皿中的培养液弃掉15ml左右,在向其中加入8ml的无血清DMEM培养液继续培养。

(7)将转染混合物逐滴加入15cm培养皿中,轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物,在37ºC5%CO2培养箱中温育4-6小时。

(8)将转染液吸除并弃掉,在培养基中加入18mlDMEM培养液(其中含10%FBS)。设置培养箱参数为37ºC,5%CO2,继续培养72小时。

2.2.2病毒收集

(1)将培养皿中细胞上清液吸到50ml离心管中,4ºC,4000rpm,4min离心。

(2)将离心管中的上清液加入到50ml的无菌注射器中,并使用0.45um的过滤器进行过滤。

(3)将滤液单独放在离心管中,并上离心机中进行超速离心,离心机参数设置:4ºC,20000rpm,离心2h。

(4)收集浓缩液,并分装到一个新的无菌出货管中。

(5)将分装好的病毒液贴上标签,放在-80ºC冰箱或液氮中暂时保存。

2.2.3病毒滴度检测

(1)将293T细胞在10cm皿中进行培养,直到细胞总量的80-90%发生融合,倒去其中的培养液,使用3mlD-Hank’s溶液,对大皿内的细胞进行洗涤2次。

(2)加入1mlTrypsin-EDTA溶液并小心混匀,吸去其中的胰酶,在37ºC下放置3-5分钟。

(3)在2mlDMEM培养液(含10%FBS),将细胞吹打后形成单细胞的悬浊液。

(4)以3×104细胞/孔的浓度,将293T细胞接种在96孔板中,充分混匀后,放在37ºC5%CO2的培养箱中连续培养24小时。

(5)将慢病毒原液从-80℃冰箱中取出,并取用10ul,使用含有10%FBSDMEM培液,将慢病毒原液进行十倍稀释,成为3-5个梯度(根据细胞状态,如有必要可加入终浓度为5ug/ml的聚凝胺)。

(6)吸除96孔板中的培养液,每孔加入100μl稀释的病毒液,同时设立空白对照组,于37ºC5%CO2培养24h。

(7)吸弃96孔板中的稀释病毒液,每孔加入100μl10%FBS的DMEM培液,(根据细胞状态,如有必要可分出1/3-1/5)于37ºC5%CO2继续培养72h。

(8)使用荧光显微镜,或者FACS技术,对培养皿中的荧光细胞进行计数,结合稀释倍数,进而估算病毒的滴度。

2.2.4慢病毒感染BMSC步骤

(1)实验前一天分别接种1×105个BMSC细胞于6孔培养板每孔中,加培养基2ml,进行病毒感染时细胞的融合率为50%。

(2)感染前为细胞换液,吸去细胞上清,加入所需的培养基2ml。

(3)按MOI为50计算,每孔加入50ul的1×108TU/ml的病毒。

(4)每孔加入终浓度为5ug/ml的Polybrene。

(5)把细胞放回培养箱孵育。

(6)24小时后更换为新鲜培养基。

(7)感染72小时后,荧光显微镜观察荧光表达情况。

2.2.5Puromycin筛选BMSC

(1)BMSC细胞以梯度puromycin(2、4、6、8、10ug/ml)处理48h以确定筛选浓度。

(2)2ug/mlpuromycin可在48h杀死全部细胞,以此作为病毒感染的阳性细胞筛选浓度。

(3)病毒感染72小时后,更换新鲜培养基,加入终浓度2ug/ml的puromycin。

(4)24小时后可见少量细胞漂浮死亡。

(5)每三天更换新的培养基和puromycin。

(6)连续筛选一周后,以荧光显微镜观察筛选效果。

2.2.6CCK-8细胞归巢检测

(1)细胞培养至50%-90%汇合度,生长状态良好,处于对数生长期时可以用于实验。

(2)PBS漂洗细胞,胰酶消化细胞到大部分脱落时加入完全培养基终止消化,吹打细胞成单个,400g离心沉淀细胞,加入新鲜培养基重悬。悬浮细胞直接离心重悬。

(3)细胞计数,贴壁细胞按3×103/孔接种至96孔板。每孔含培养基200ul。周的孔加入200ulPBS封边。

(4)细胞板置于CO2培养箱中培养过夜,使细胞贴壁。

(5)第二天,对照组和ESR1组各选3孔,吸去培养基,每孔加入100ul新鲜培养基和10ulCCK-8试剂。未接种细胞的孔加入100ul新鲜培养基和10ulCCK-8试剂作为空白对照。

(6)37℃反应1-4小时后在450nm处检测吸光度值。

(7)之后每隔2天检测一次。

2.2.7细胞周期检测

(1)稳定感染的细胞以1×105/孔接种6孔板。

(2)培养24h后以胰酶消化,完全培养基终止消化。

(3)400g,5min离心沉淀细胞并以PBS洗涤一次。

(4)离心沉淀细胞,加入300ul4℃预冷的PBS重悬。

(5)边涡旋细胞边逐滴加入700ul-20℃预冷的无水乙醇,以固定细胞。

(6)细胞置-20℃冰箱固定过夜。

(7)离心沉淀细胞,PBS洗涤一次。

(8)沉淀去除上清,以500ulPI/RnaseStainingBuffer重悬并室温避光染色15min。

(9)FACSCaliber流式细胞仪检测细胞周期。

(10)ModfitLT软件分析实验结果。

2.2.9细胞迁移检测

(1)胰酶消化细胞,完全培养基终止消化并离心沉淀细胞。

(2)以无血清培养基重悬细胞,调整细胞浓度为2×105/ml。

(3)24孔板加入600-800ul含血清培养基,放入小室,小室内加入100-150ul细胞悬液。继续培养12-24小时.

(4)用镊子取出小室,吸干上室液体,棉签擦除上室细胞。

(5)小室置甲醇中固定15min,然后晾干。

(6)小室置0.1%结晶紫染色液中染色15min,PBS洗三遍。拍照计数细胞转移情况。

2.3TRIzol法抽提BMSC细胞总RNA[20]

  提取细胞总RNA时,应当带口罩和帽子进行操作,避免皮肤表面的RNA酶掉入操作区域,影响提纯结果。(1)培养BMSC细胞浓度在1×107为宜;从37℃孵育箱中取出BMSC细胞的培养皿,加入1mlTRIzol,用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块;(2)匀浆并放入新的EP管中;颠倒混匀十几下,20℃室温下放置5分钟;加入1/5体积(0.2ml)的氯仿溶液;混匀十几下,室温下放置5分钟。(3)4℃离心,速度12000g,设定离心时间为10-15分钟;吸除EP管中上层水相部分,并迅速转移至一个全新的无菌1.5mlEP管中,并在EP管中添加体积相同的异丙醇溶液(400μl),充分混匀。在20℃或室温下,静置10分钟,设置离心机参数:温度4℃,离心速度12000g,离心时间为10分钟,弃去上清液,加入提前预冷的75%乙醇溶液,注意:在配置过程中,防止RNA酶对实验结果的影响,乙醇溶液应当使用DEPC水进行配置。体积为1ml;设置离心机参数:温度4℃,速度:7500g,离心时间5分钟;弃去上清液,放在空气中,干燥5-10分钟后,注意不能使样品完全干燥,影响测定结果;进一步,将样品溶于DEPC水中,并添加DEPC水到体积为20μl或10μl-20μl左右。或可在55-60℃水中,放置10分钟后进行助溶。(4)注意:1)如果RNA用于核酸转移,则应当在样本的缓冲液中进行溶解,不然会引起DEPC发生溶解;2)在细胞组织中加入TRIzol匀浆之后,可以在-60℃-80℃的条件下保存至少一个月,如果温度控制得当,部分样品可以保存在一年以上;3)将RNA放在75%乙醇中保存,2-8℃可保存一周,-20℃至少可保存一年。

2.4BMSC细胞蛋白质的提取[21]2.4.2实验方法

收集细胞:(1)细胞融合程度达到100%时,进行细胞收集;弃培养基,加入PBS2ml清洗培养皿一次,弃PBS。(2)加入0.05%胰酶2ml,37℃温育1min,等细胞发生变形后,使用移液器反复吹打细胞,并转移到一个全新的1.5ml无菌Ependorf管中,设置离心机参数10000rpm×3min,离心温度4℃;(3)弃上清,1ml预冷的PBS清洗沉淀,10,000rpm×3min,4℃;(4)重复PBS清洗一次;弃上清。

蛋白提取:(1)向细胞沉淀中加入200μlRIPA缓冲液(含1mMPMS、1mMNaF、2μg/mlAprotinin、2μg/mlLeupetin),混匀后冰上放置40mins;(2)10,000rpm×15min,4℃;将上清转移至一个新的ependorf管中(约250μl)2.5样本制备[22]一般情况下,初步提取的样品并不需要进一步的分离和纯化,一般可以直接用于凝胶电泳。但有时候使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。(1)待测标本中含蛋白量极稀少,因为适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有一定限度,通常不可能在凝胶中加足够量的蛋白质样品来检测含量极稀少的抗原,此时可用标准免疫沉淀技术,对蛋白进行纯化和浓缩;(2)免疫沉淀法用来对不同蛋白之间的相互作用进行确认,此时,用于免疫沉淀的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质,如复合物的性质明确,并确定所使用的抗体时,这种方法就十分有用,为研究不同蛋白之间的相互作用的方法提供了一种有效的方法。

2.5.1操作步骤

(1)不同蛋白微珠提前洗涤后,吸附抗原和抗体。样品缓冲液加入其中。体积比2:1-5:1,一般不超过10:1.;(2)样品放入70°C水浴加热5min。一般在凝胶加样前不必特意取出微珠;(3)样品可立即使用也可冻存保存。-20°C存放的样品可稳定保存数月。2.6实时定量PCR(RT-PCR)[23]

2.6.1逆转录酶和RT-PCR:逆转录酶(reversetranscriptase)是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性:1)依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA第一条链;2)Rnase水解活性:水解RNANA杂合体中的RNA;3)依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。

2.6.2逆转录反应体系配置:

试剂体积

RNA23μl

Oligo(dT)4μl

(稀释10倍后用)混匀,离心,70℃5min,立即冰水浴,稍离心。

试剂体积

M-MLVBuffer5×8μl

1×dNTP2μl

Rnasin1μl

M-MLV2μl

注:反应体系总体积40μl(20ml)混匀,离心,42℃60min;95℃10min(破坏MLV)4℃保存

2.6.5PCR反应反应体系配置:

试剂体积

TaqBuffer10×2μl

MgCl21.2ul

dNTP0.2ul

上游引物0.3ul

下游引物0.3ul

DEPC水20μl

cDNA模板1-10μl

引物序列:Actinbeta

F:CCCATCTATGAGGGTTACGC

R:TTTAATGTCACGCACGATTC

ESR1

F:CGAGCACATTCCTTCCTTCCG

R:TTTGGTGTGAAGGGTCATGGT

CXCL12

F:TCTTTGAGAGCCATGTCGCC

R:CCTTTGGGCTGTTGTGCTTAC

CXCR4

F:TCTGAGGCGTTTGGTGCTC

R:GTTTTCATCCCGGAAGCAGG

VEGF

F:TCGGTTCCAGAAGGGAGAGG

R:AGATGTCCACCAGGGTCTCA

CyclinD1

F:GCGAGCCATGCTTAAGACTGA

R:TCTGCACGCACTTGAAGTAAGAA

2.6.6琼脂糖凝胶的配制:

(1)1.0%的琼脂糖凝胶配置:使用科学天平称取1.0g的琼脂糖,并加入到100ml10XTAE溶液中,在微波炉中加热30s,指导溶液稍微沸腾后,将琼脂糖凝胶溶液取出,熔化的琼脂物质进而冷却至60℃,并向其中加入10mg/ml的溴化乙锭(EB)溶液2.5μl,充分混匀后,在室温下稍微冷却,将温热的琼脂糖凝胶灌到已经提前插好梳子的模具当中,室温放置30-45min后,再在电泳槽中进行点样与电泳。

(2)1.5%的琼脂糖凝胶配置方法:基本配置方法和步骤同上,但是需要将琼脂糖的质量改为1.5g。

2.7蛋白质凝胶电泳

2.7.1操作步骤

(1)准备清洁玻璃板两块,组成灌胶模具。

(2)按照配胶试剂说明书配置配制8%分离胶10ml。

(3)分离胶液混合后,使用移液器添加到(1)中组合好的玻璃板之间,沿凝胶板内壁加2~3mm的正丁醇或无水乙醇,分离胶聚合后,倒去表面的溶液分离胶缓冲液冲洗及滤纸吸干。

(4)按照说明书配制5%浓缩胶5ml。

(5)混合浓缩胶之后,将溶液加入到分离胶的表面,到凹口玻璃板上缘。并小心插入梳子。注意排除气泡。半小时至1小时后,再拔出梳子,剩下装样孔,四周使用乳胶管封闭,凝胶板和上、下电泳槽分别连接完好。

(6)将待测的蛋白液按照1:4的比例加入到缓冲液中,蛋白质的分子量标准应当按照具体的商品说明书进行处理。之后,在沸水浴中,煮沸3~5分钟。并将样品加入到样品槽中。

(7)样品在凝胶中泳动,设置电泳电压100V,蛋白样放入到分离胶内,调节电泳电压到150~200V。为了防止电泳过程中产热量过多,应在电泳过程中外接冷却水装置,如不能利用冷却水循环,可以使用冰进行降温。

(8)当缓冲液中的溴酚蓝指示剂移至凝胶的最底部时,就可以终止电泳了。小心取出电泳槽中的凝胶板,将两板之间的胶移放到一个较大的表面皿中。这时候,凝胶上可直接进行染色观察;也可以进一步使用免疫印迹技术,对待测的蛋白质进行进一步检测。

2.8.3注意事项

把膜与胶放在中间,上下加滤纸数层,做成三明治样的转移单元,使得带负电的蛋白质向阳极转移,即膜侧连接阳极或面向阳极。

2.9转膜

2.9.1操作步骤

(1)电泳后,切除成层胶,放在转移液中平衡半小时。

(2)准备1张转印膜,6张滤纸。使用前提前平衡15min,滤纸在转移缓冲液中浸湿;由下至上将滤纸、膜、凝胶排放整齐。排净气泡。

(3)将电转装置连好,接电源。设置为恒流模式:0.8mA/cm2,转移半个小时到一个小时。

2.9.2检测

(1)在塑料盒中加封闭液,转膜4℃过夜;加封闭液稀释的一抗,37℃孵育1小时。

(2)回收一抗,膜移至塑料盒中,加TBS洗3次,每次洗一刻钟。

(3)加二抗,37℃孵育30-60min。

(4)同步骤(3),洗膜。

(5)加显色液。避光。

(6)终止反应,使用双蒸水冲洗,然后将膜放于双层滤纸中干燥保存。

2.9.3操作步骤

(1)配置好的丽春红S液膜洗PVDF1次。

(2)加入新鲜稀释丽春红S液,室温搅动5~l0min。

(3)将PVDF放入PBS中漂洗,每次1~2min。

 

实验所需耗材:

细胞培养板

细胞培养瓶

细胞培养皿

玻底培养皿

玻底培养板

细胞爬片

细胞刮刀

细胞筛网

血清瓶

细菌培养皿

康宁(corning)

耐思(NEST)

伯乐(BIO-RAD)

硕华(Sorfa)

皎洁(JIAO JIE)

密理博(millipore)

创博环球(GLOBALEBIO)

耐思细胞培养皿1150mm

新星(NEWSTAR)

白鲨易(biosharp)

科进(Kirgen)

卧宏生物(WHB)

爱思进(Axygen)

科晶(Crystalgen)

肖特(SCHOTT)

细胞培养板6孔

细胞培养板12孔

细胞培养板24孔

细胞培养板48孔

细胞培养板96孔

细胞培养锥形瓶

细胞培养透气盖悬浮摇瓶

细胞培养锥形瓶125ML

细胞培养锥形瓶250ML

细胞培养锥形瓶500ML

细胞培养锥形瓶1000ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶125ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶250ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶500ML

细胞培养透气盖悬浮摇瓶1000ML

硕华细胞培养瓶T25

硕华细胞培养瓶T75

硕华细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T25

耐思细胞培养瓶T75

耐思细胞培养瓶T125

耐思细胞培养瓶T175

耐思细胞培养瓶T225

细胞培养瓶密封盖

细胞培养瓶密封盖

雷磁

求精

广州洁特(jet)

盐城华鸥

蜀牛

kimble chase

Falcon

WATSON

罗氏(Roche)

金佰利

科默斯

武汉华美生物(CUSABIO)

其林贝尔(Kylin-Bell)

Biofroxx

Pall

爱马斯(AMMEX)

麦迪康(Medicom)

世泰(CITOTEST)

Parafilm

古洛玻璃(GOLO)